馬利奮，尹 躍，趙建華，王亞軍，戴國禮，安 巍，*

(1.寧夏枸杞產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，寧夏 銀川 750001； 2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 國家枸杞工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750002)

枸杞(LyciumbararumL.)系茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)，多年生落葉灌木植物。全球約有80個(gè)種，在全球呈離散分布，主要分布在歐亞大陸、非洲南部、北美洲南部和南美洲南部；中國有7個(gè)種和3個(gè)變種。中國枸杞栽培面積穩(wěn)居世界第一[1-2]。從枸杞種質(zhì)資源的收集保存數(shù)量上來看，中國處于世界領(lǐng)先地位，豐富的種質(zhì)資源為枸杞的遺傳改良和新品種培育提供了豐富的材料。目前，已選育審定了20多個(gè)枸杞品種[3]，主要采用群體選優(yōu)和常規(guī)雜交育種方式，如寧杞1號、寧杞2號和寧杞4號都是從農(nóng)家品種大麻葉生產(chǎn)園選育的。枸杞具有自交不親和、基因組雜合度較高等特點(diǎn)，自然選擇使得枸杞遺傳背景極其復(fù)雜，品種間的親緣關(guān)系不明確。同時(shí)，不同枸杞產(chǎn)區(qū)枸杞品種引種比較頻繁，導(dǎo)致同物異名、同名異物的現(xiàn)象普遍存在。因此，對枸杞品種資源遺傳多樣性研究極為重要。

隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記在種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中得到廣泛應(yīng)用。目前，RAPD[4]、SSR[5-6]、SRAP[7]和ISSR[8]等標(biāo)記已應(yīng)用于枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性研究。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(start codon targeted polymorphism，SCoT)標(biāo)記是一種基于PCR技術(shù)的新型顯性分子標(biāo)記，由Collard等[9]提出，最早應(yīng)用于水稻，是根據(jù)植物基因組中ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守型，設(shè)計(jì)單引物對基因組區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生偏向候選功能基因區(qū)的顯性多態(tài)性標(biāo)記。Pratik等[10]利用24條SCoT引物對5個(gè)居群的155份苧麻進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示印度苧麻群體SCoT多態(tài)性較高(>50%)，遺傳差異大(GST=0.27)。Que等[11]選用20條SCoT引物對107份甘蔗進(jìn)行遺傳多樣性分析，多態(tài)信息含量(Polymorphism information content, PIC)平均值為0.861，遺傳多樣性豐富。Jiang等[12]采用24條SCoT引物對95份鴨茅進(jìn)行遺傳多樣性分析，擴(kuò)增檢測到多態(tài)性條帶數(shù)228條，多態(tài)性比率為83.4%。Huang等[13]利用7條SCoT引物構(gòu)建了6個(gè)牛鞭草栽培品種的DNA指紋圖譜。楊祥燕等[14]利用SCoT標(biāo)記對22個(gè)番木瓜主要栽培品種進(jìn)行遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建，其中6個(gè)SCoT標(biāo)記可將22個(gè)品種完全區(qū)分開。利用SCoT標(biāo)記技術(shù)對枸杞進(jìn)行遺傳多樣性研究的文獻(xiàn)較少，查美琴等[15]利用SCoT標(biāo)記對新疆枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行研究，9條SCoT引物擴(kuò)增檢測到219條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為85.62%；UPGMA聚類分析將30份種質(zhì)分為2大類和4個(gè)亞類。本研究利用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)，對17個(gè)枸杞品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在從DNA水平上揭示枸杞品種的親緣關(guān)系及遺傳特性，以期為枸杞新品種選育、親本選配、品種資源保護(hù)等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

17個(gè)枸杞主要栽培品種(表1)，均采自于寧夏農(nóng)林科學(xué)院國家枸杞工程技術(shù)研究中心枸杞種質(zhì)資源圃(38°38′49″N，106°9′10″E)。其中，寧杞菜1號和天精3號為菜用品種，其余品種均為果用品種。于2016年5月采集幼嫩葉片保存在液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器及試劑

主要儀器有冷凍研磨儀(MM400，德國Retsch)、臺式高速冷凍離心機(jī)(5810R，德國Eppendorf)、核酸蛋白檢測儀(BioPhotometer Plus，德國Eppendorf)、PCR儀(PTC-200，美國Bio-Rad)、水平電泳儀(DYY-10C，北京六一)和全自動(dòng)凝膠成像儀(AlphaImager HP，美國Alpha Inotech)。試劑主要有基因組DNA提取試劑盒、DL 2 000 Marker、2×TaqPlus Master mix、瓊脂糖凝膠和50×TAE緩沖液，以上試劑均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與檢測

枸杞葉片DNA提取采用天根基因組DNA試劑盒(DP320-02)，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白儀檢測其質(zhì)量和濃度，將符合實(shí)驗(yàn)要求的DNA稀釋至50 ng·μL-1工作濃度，保存-4 ℃冰箱用于后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 SCoT引物篩選

80條SCoT引物序列參考文獻(xiàn)[9]，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。選用表型性狀差異較大的4個(gè)品種，寧杞1號、寧杞5號、寧杞菜1號和天精3號進(jìn)行多態(tài)性引物的篩選(表2)。

1.3.3 SCoT-PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系25 μL：DNA模板1 μL(50 ng·μL-1)，引物1.7 μL(10 μmol·L-1)，2×TaqPlus Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.8 μL。SCoT-PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。

表1供試17個(gè)枸杞品種

Table1Seventeen goji (wolfberry) cultivars used in this study

序號No.品種名稱Cultivar names選育單位Breeding institutes類型Type1寧杞1號Ningqi 1寧夏農(nóng)林科學(xué)院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品種 Fruit cultivar2寧杞2號 Ningqi 2寧夏農(nóng)林科學(xué)院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品種 Fruit cultivar3寧杞3號 Ningqi 3寧夏農(nóng)林科學(xué)院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品種 Fruit cultivar4寧杞4號 Ningqi 4寧夏中寧縣枸杞產(chǎn)業(yè)管理局Ningxia, Zhongning of Wolfberry Industry Authority果用品種 Fruit cultivar5寧杞5號 Ningqi 5寧夏農(nóng)林科學(xué)院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品種 Fruit cultivar6寧杞6號 Ningqi 6寧夏林業(yè)研究所股份有限公司Ningxia Forestry Institute Co., Ltd.果用品種 Fruit cultivar7寧杞7號 Ningqi 7寧夏農(nóng)林科學(xué)院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品種 Fruit cultivar8寧杞菜1號 Ningqicai 1寧夏農(nóng)林科學(xué)院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences菜用品種 Vegetable culti-var9寧農(nóng)杞1號 Ningnongqi 1寧夏農(nóng)林科學(xué)院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品種 Fruit cultivar10寧農(nóng)杞2號 Ningnongqi 2寧夏農(nóng)林科學(xué)院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品種 Fruit cultivar11寧農(nóng)杞3號 Ningnongqi 3寧夏農(nóng)林科學(xué)院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品種 Fruit cultivar12寧農(nóng)杞9號 Ningnongqi 9寧夏農(nóng)林科學(xué)院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品種 Fruit cultivar13蒙杞1號 Mengqi 1內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學(xué)院Inner Mongolia Academy of Agriculture and Animal Sciences果用品種 Fruit cultivar14天精3號 Tianjing 3河北科技師范學(xué)院 Hebei Normal University of Science &Technology菜用品種Vegetable culti-var15大麻葉 Damaye寧夏農(nóng)林科學(xué)院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品種 Fruit cultivar16小麻葉 Xiaomaye寧夏農(nóng)林科學(xué)院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品種 Fruit cultivar17白花 Baihua寧夏農(nóng)林科學(xué)院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品種 Fruit cultivar

表2十九條SCoT引物序列及其擴(kuò)增多態(tài)性結(jié)果

Table2Sequence and polymorphism information of 19 SCoT primers

引物名稱Primer name引物序列(5'—3')Primer sequence總條帶數(shù)Total numberof bands多態(tài)性條帶數(shù)Number ofpolymorphic bands 多態(tài)性百分率Percent bandpolymorphism/%多態(tài)信息含量PICSCoT-21ACGACATGGCGACCCACA5480.000.108SCoT-24CACCATGGCTACCACCAT88100.000.135SCoT-25ACCATGGCTACCACCGGG3266.670.106SCoT-29CCATGGCTACCACCGGCC4250.000.055SCoT-30CCATGGCTACCACCGGCG5360.000.116SCoT-31CCATGGCTACCACCGCCT5240.000.064SCoT-32CCATGGCTACCACCGCAC5480.000.177SCoT-41CAATGGCTACCACTGACA3266.670.106SCoT-48ACAATGGCTACCACTGGC8787.500.109SCoT-49ACAATGGCTACCACTGCG5480.000.199SCoT-55ACAATGGCTACCACTACC5360.000.233SCoT-58ACAATGGCTACCACTAGG7571.400.133SCoT-64ACCATGGCTACCACGGTC5360.000.127SCoT-65ACCATGGCTACCACGGCA3266.670.106SCoT-66ACCATGGCTACCAGCGAG8787.500.239SCoT-72CCATGGCTACCACCGCCC6466.670.104SCoT-73CCATGGCTACCACCGGCT33100.000.111SCoT-76CCATGGCTACCACTACCG44100.000.159SCoT-78CCATGGCTACCACTAGCA4250.000.125總數(shù)Total9671平均Average5.053.7473.960.132

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，在凝膠的相同遷移位置上有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，只統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增清晰的條帶，建立SCoT標(biāo)記的(0，1)數(shù)據(jù)矩陣。利用GD calculation[16](http://plantmolgen.iyte.edu.tr/GDdom/)計(jì)算多態(tài)信息含量。采用NTSYSpc-2.1軟件[17]的SIMQUAL模塊計(jì)算簡單匹配(simple matching，SM)系數(shù)，SHAN模塊非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ScoT擴(kuò)增多態(tài)性

從80條SCoT引物中篩選出19條穩(wěn)定性好、擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的引物。用這19條引物對17個(gè)枸杞品種基因組DNA進(jìn)行SCoT擴(kuò)增，共擴(kuò)增到96個(gè)條帶；其中，多態(tài)性條帶71條，多態(tài)性比率73.96%，平均每對引物可擴(kuò)增出多態(tài)性條帶3.74條，多態(tài)信息含量變化范圍為0.055(SCoT-29)～0.239(SCoT-66)，平均為0.132(表2)。引物SCoT-24和SCoT-55對17個(gè)枸杞品種PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1和圖2。

2.2 遺傳相似性分析

根據(jù)19條多態(tài)性SCoT引物對供試枸杞品種的擴(kuò)增結(jié)果，利用NTSYS-pc軟件計(jì)算品種間的遺傳相似系數(shù)。結(jié)果(表3)顯示，17個(gè)枸杞品種間的相似系數(shù)為0.43～1.00，平均為0.86，其中大麻葉和小麻葉遺傳相似系數(shù)最大(1.00)，說明它們之間的親緣關(guān)系較近。相似系數(shù)最小(0.43)的是蒙杞1號與天精3號，說明它們之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。相似系數(shù)分布在0.72～1.00的品種占總數(shù)的88.24%，相似系數(shù)小于0.72的品種僅占11.76%。結(jié)果說明，供試枸杞品種的遺傳相似性較高，遺傳多樣性較低。

M，DL 2 000 marker；1～17，材料編號同表1。M，DL 2 000 marker; 1-17，Material codes were the same as table 1.圖1 引物SCoT-24(A)和SCoT-55(B)的PCR擴(kuò)增圖譜Fig.1 PCR amplification profile of primers SCoT-24 (A) and SCoT-55 (B)

表3十七個(gè)枸杞品種間的遺傳相似系數(shù)

Table3The genetic similarity coefficients for 17 goji (wolfberry) cultivars

序號No.123456789101112131415161711.0020.921.0030.920.921.0040.890.930.891.0050.890.910.930.901.0060.890.910.930.920.921.0070.910.990.910.920.900.901.0080.800.820.800.830.790.810.811.0090.900.900.940.870.930.950.890.781.00100.900.920.940.910.970.930.910.800.921.00110.930.970.930.920.920.920.960.810.930.931.00120.910.910.950.920.920.940.900.810.930.930.921.00130.900.900.940.910.910.950.890.800.960.920.910.971.00140.470.490.450.480.440.460.480.590.450.450.480.440.431.00150.960.960.960.930.930.930.950.840.940.940.970.950.940.491.00160.960.960.960.930.930.930.950.840.940.940.970.950.940.491.001.00170.880.880.920.870.930.890.890.760.920.920.890.910.900.470.920.921.00

1～17，材料編號同表1。

1-17，Material codes were the same as table 1.

2.3 聚類分析和主坐標(biāo)分析

利用UPGMA法構(gòu)建17個(gè)枸杞品種的聚類圖。從聚類圖(圖2)可以看出，在遺傳相似系數(shù)閾值為0.87處，可將17個(gè)枸杞品種分成3大類。第Ⅰ大類包括15個(gè)品種：寧杞1號、寧杞2號、寧杞7號、寧農(nóng)杞3號、大麻葉、小麻葉、寧杞4號、寧杞3號、寧農(nóng)杞9號、蒙杞1號、寧杞6號、寧農(nóng)杞1號、寧杞5號、寧農(nóng)杞2號和白花枸杞，它們均是果用品種。第Ⅱ大類和第Ⅲ大類各包括1個(gè)品種，分別為寧杞菜1號和天精3號，它們均是菜用枸杞品種。

基于遺傳相似性系數(shù)對供試枸杞品種進(jìn)行主坐標(biāo)分析，結(jié)果(圖3)顯示，第一主坐標(biāo)和第二主坐標(biāo)解釋了44.2%和21.3%的品種間相關(guān)性。主坐標(biāo)分析的劃分結(jié)果與聚類分析結(jié)果高度一致，將位置靠近的枸杞品種劃分在一起，可明顯分為3大類(Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ)。主坐標(biāo)分析更能直觀清楚地顯示供試枸杞品種間的親緣關(guān)系。

圖2 基于SCoT標(biāo)記的17個(gè)枸杞品種聚類分析圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 17 wolfberry cultivars based on SCoT markers

圖3 基于SCoT標(biāo)記的17個(gè)枸杞品種主坐標(biāo)分析圖Fig.3 Principal coordinated analysis of 17 goji (wolfberry) cultivars based on SCoT markers

3 討論

枸杞品種選育方式主要是基于群體選優(yōu)，由于骨干親本重復(fù)利用，使得品種形態(tài)特征相似，利用形態(tài)特征辨別耗時(shí)費(fèi)力。基于PCR基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)不易受環(huán)境、時(shí)間等影響，已成為枸杞品種遺傳多樣性研究的重要技術(shù)手段。本研究利用19條SCoT引物對17個(gè)枸杞品種進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增到96個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶71條，多態(tài)性比率為73.96%。多態(tài)信息含量為0.055～0.239，平均為0.132。Ntsys-pc軟件計(jì)算17個(gè)枸杞品種間遺傳相似系數(shù)為0.43～1.00。UPGMA聚類分析顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.87處，可將17個(gè)枸杞品種分為3大類。17個(gè)枸杞品種的遺傳相似性較高，遺傳多樣性較低，這與SSR標(biāo)記研究結(jié)果相一致[18]，11對SSR引物檢測12個(gè)枸杞品種，遺傳相似系數(shù)為0.57～0.91，PIC平均值為0.391。2種標(biāo)記(SCoT和SSR)PIC值均小于0.5，但SSR標(biāo)記PIC值大于SCoT標(biāo)記。說明目前選育的枸杞品種遺傳相似性較高，遺傳多樣性低。