鄭曉葉，鄭天倫，曹飛飛，朱凝瑜，丁理法，王國(guó)良

(1.浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江 杭州 310023； 2.溫嶺市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江 臺(tái)州 317500； 3.寧波大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211)

青蛤(Cyclinasinensis)隸屬瓣鰓綱(Lamellibranchia)簾蛤科(Veneridae)環(huán)文蛤?qū)?Cyclina)，為濾食性底棲貝類。隨著青蛤規(guī)?；斯び缂夹g(shù)的突破[1]，我國(guó)江蘇、浙江、遼寧等地沿海青蛤規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)得到迅猛發(fā)展[2]。隨著養(yǎng)殖歷史的延長(zhǎng)、養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的加大，養(yǎng)殖環(huán)境日趨惡化，致使青蛤病害問(wèn)題也開(kāi)始頻繁發(fā)生。通州[3]、連云港[4]、溫州[5]、溫嶺等地青蛤均出現(xiàn)了大規(guī)模死亡的現(xiàn)象，不僅給養(yǎng)殖戶造成大量的經(jīng)濟(jì)損失，也阻礙了青蛤養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康有序發(fā)展。

在養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境中，異養(yǎng)細(xì)菌具有重要地位和作用，與養(yǎng)殖生物生長(zhǎng)的關(guān)系極為密切，是海水養(yǎng)殖環(huán)境研究中不可缺少的重要內(nèi)容，是正確評(píng)價(jià)海水養(yǎng)殖生態(tài)結(jié)構(gòu)與功能的重要因素[6-8]，大多數(shù)病原菌為異養(yǎng)細(xì)菌[9]?；【谒a(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中是一類重要的條件致病菌[9]，研究弧菌數(shù)量的變動(dòng)旨在監(jiān)測(cè)水體中有害菌群的變動(dòng)規(guī)律，對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)做出指導(dǎo)。養(yǎng)殖環(huán)境中的各種理化因子之間的相互作用，將影響?zhàn)B殖生物的生長(zhǎng)與繁殖，青蛤營(yíng)埋棲生活，池塘水質(zhì)和底質(zhì)狀況對(duì)其生長(zhǎng)都極為重要。由于養(yǎng)殖池塘環(huán)境的自身特點(diǎn)，其生態(tài)平衡和結(jié)構(gòu)與功能的完善通常需要依靠人工調(diào)節(jié)[10]。異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量變化可間接反映池塘環(huán)境理化因子的變化趨勢(shì)，因此，養(yǎng)殖生產(chǎn)中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)異養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量變化，有利于池塘環(huán)境生態(tài)平衡的有效調(diào)控。國(guó)內(nèi)外研究者利用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)方法對(duì)南美白對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[11-12]、大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)[13-15]、九孔鮑(Haliotisdiversicolorsupertexta)[16]、海參(Apostichopusjaponicus)[17-18]、牡蠣(Crassostreahongkongensis)[19]等海水養(yǎng)殖動(dòng)物及其養(yǎng)殖水體、養(yǎng)殖區(qū)沉積物中細(xì)菌及理化因子都有較多研究，而青蛤養(yǎng)殖環(huán)境異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量變化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文以浙江省溫嶺市青蛤海水圍塘養(yǎng)殖為對(duì)象，研究養(yǎng)殖塘水體、底泥及青蛤腔液中異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌在不同季節(jié)的數(shù)量變化，為青蛤的健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣圍塘

實(shí)驗(yàn)樣品采集于浙江省溫嶺市龍王青蛤養(yǎng)殖場(chǎng)，選取池塘條件相同的6個(gè)不同放養(yǎng)密度、面積約13 340 m2的養(yǎng)殖圍塘，密度梯度設(shè)置如下：4×104、6.2×104、8×104、1.57×105、1.64×105、2×105?！?67m-2，依次編號(hào)為1、2、3、4、5、6，每個(gè)密度組設(shè)1個(gè)試驗(yàn)塘，放養(yǎng)稚貝規(guī)格為60～320?！g-1。

1.2 樣品采集與處理

采樣周期為5月至12月，每月初采集一次共采樣8次。樣品均放置于保溫冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.1 水樣

用采水器采集20～40 cm深度的水樣500 mL，置于樣品瓶中帶回。取1 mL水樣置于滅菌試管中加入滅菌海水9 mL進(jìn)行梯度稀釋。

1.2.2 泥樣

取底泥20 g左右置于一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿中，以封口膜固定培養(yǎng)皿帶回。稱取1 g底泥置于無(wú)菌離心管中，加入9 mL滅菌海水，梯度稀釋。

1.2.3 青蛤

每個(gè)養(yǎng)殖塘選取3個(gè)采樣點(diǎn)隨機(jī)采集不少于20枚青蛤置于一次性無(wú)菌樣品袋中帶回。從每個(gè)樣品袋中隨機(jī)取青蛤10枚，取腔液置于滅菌離心管中，用滅菌海水梯度稀釋。

1.3 細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定

1.3.1 異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)

取0.2 mL梯度稀釋樣品置于無(wú)菌培養(yǎng)皿，倒入適量50%海水配制的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，每個(gè)稀釋梯度做2個(gè)重復(fù)，待培養(yǎng)基冷卻凝固后倒置于28 ℃下培養(yǎng)48 h。取菌落數(shù)在30至300的平板進(jìn)行有效計(jì)數(shù)，分別計(jì)算水樣、泥樣和青蛤腔液中的異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)。

1.3.2 弧菌數(shù)量

取0.2 mL梯度稀釋樣品置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒入適量TCBS培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋梯度做2個(gè)重復(fù)，待培養(yǎng)基冷卻凝固后倒置于28 ℃下培養(yǎng)48 h，取菌落數(shù)在30至300的平板進(jìn)行有效計(jì)數(shù)，分別計(jì)算水樣、泥樣和青蛤腔液中的弧菌總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件整理，運(yùn)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。各塘或樣品之間的差異性采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，當(dāng)P<0.05時(shí)差異性水平達(dá)到顯著，當(dāng)P<0.01時(shí)差異極顯著。相關(guān)性用Pearson相關(guān)系數(shù)表示，當(dāng)P<0.05時(shí)相關(guān)性顯著，當(dāng)P<0.01時(shí)相關(guān)性極顯著。圖表繪制使用Origin 8.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量和弧菌數(shù)量變動(dòng)

如圖1-A所示，采樣周期中各養(yǎng)殖塘水體中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，但是放養(yǎng)密度相近的池塘呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，如1塘和2塘變化趨勢(shì)一致，5月至9月逐漸增大，9月至12月逐漸減少。水體中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的變化范圍為(2.5×102～5.6×105)cfu·mL-1，1塘數(shù)量最高，平均為8.8×104cfu·mL-1，3塘最低，平均為6.8×103cfu·mL-1。采樣期間，3和4塘異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量變化范圍不大，其余4個(gè)塘雖存在較大波動(dòng)，但單因素方差分析顯示，異養(yǎng)細(xì)菌隨時(shí)間的數(shù)量變化的差異性不顯著(F=1.257，P>0.05)；從空間上看，各養(yǎng)殖塘水體中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量變化的差異性不顯著(F=0.707，P>0.05)。

由圖1-B得知，各養(yǎng)殖塘水體中弧菌數(shù)量呈現(xiàn)較為一致的變化趨勢(shì)，2塘數(shù)量最高，平均為1.3×103cfu·mL-1，6塘最低，平均為2.7×102cfu·mL-1。整個(gè)采樣周期中，單因素方差分析顯示，各養(yǎng)殖塘水體中弧菌隨時(shí)間的數(shù)量變化的差異性顯著(F=2.673，P<0.05)，9月份水樣中弧菌數(shù)量與其他月份有顯著差異；從空間上看，各個(gè)養(yǎng)殖塘水體中弧菌數(shù)量變化差異不顯著(F=0.750，P>0.05)。

2.2 底泥中異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌數(shù)量變動(dòng)

各養(yǎng)殖塘底泥中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的變化如圖2-A所示，變化范圍1.3×103～1.3×105cfu·g-1，1塘和5塘變化較大。采樣期間1塘異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量最高，平均為4.3×104cfu·g-1，3塘最低，平均為1.1×104cfu·g-1；但單因素方差分析顯示，各塘異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)隨時(shí)間的數(shù)量變化的差異不顯著(F=0.763，P>0.05)；從空間上看，各養(yǎng)殖塘底泥中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)變化差異不顯著(F=1.954，P>0.05)。

圖1 不同月份各養(yǎng)殖塘水體中異養(yǎng)細(xì)菌(A)和弧菌(B)數(shù)量的變化Fig.1 The change trend of total heterotrophic bacteria (A) and the Vibrio number (B) in water for all ponds

各養(yǎng)殖塘底泥中弧菌數(shù)量變化如圖2-B所示，變化范圍為0～9.9×103cfu·g-1，5塘弧菌數(shù)量最高，平均為2.6×103cfu·g-1，1塘最低，平均為75 cfu·g-1。采樣期間各塘底泥中弧菌數(shù)量處于較低水平(0～8.5×102cfu·g-1)，而4塘12月份弧菌數(shù)量達(dá)到1.7×103cfu·g-1，5塘11月份和12月份弧菌數(shù)量超過(guò)9.0×103cfu·g-1。從時(shí)間上看，整個(gè)采樣周期中各養(yǎng)殖塘底泥中弧菌數(shù)量變化的差異不顯著(F=0.994，P>0.05)；從空間上看，各養(yǎng)殖塘底泥中弧菌數(shù)量變化差異顯著(F=2.605，P<0.05)，5塘與其他養(yǎng)殖塘底泥中弧菌數(shù)量變化差異顯著。

2.3 同一池塘水體和底泥中異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌數(shù)量變動(dòng)

同一養(yǎng)殖塘水體中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)(WT)和弧菌數(shù)(WV)及底泥中的異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)(ST)和弧菌數(shù)(SV)變化如圖3所示。各養(yǎng)殖塘水樣異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)和弧菌數(shù)量變化趨勢(shì)較為一致，Pearson相關(guān)性分析顯示養(yǎng)殖密度與水樣中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)和弧菌數(shù)量的變化均呈不顯著負(fù)相關(guān)，異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量變化與養(yǎng)殖密度相關(guān)性為(r=-0.024，P>0.05)，弧菌數(shù)量變化與養(yǎng)殖密度相關(guān)性為(r=-0.126，P>0.05)，水樣中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)與弧菌數(shù)量變化呈顯著正相關(guān)(r=0.335，P<0.05)；各養(yǎng)殖塘底泥中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)和弧菌數(shù)量變化趨勢(shì)基本一致，Pearson相關(guān)性分析顯示，底泥中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)變化與弧菌數(shù)量變化呈極顯著正相關(guān)(r=0.587，P<0.01)；異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)與養(yǎng)殖密度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.116，P>0.05)，弧菌數(shù)量變化與養(yǎng)殖密度呈正相關(guān)(r=0.181，P>0.05)，底泥中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量變化與水體中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量變化呈正相關(guān)(r=0.015，P>0.05)，但相關(guān)性均不顯著。

2.4 青蛤腔液中異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌數(shù)量變化

圖4-A所示，各養(yǎng)殖塘青蛤腔液中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)變化范圍為95～5.9×104cfu·mL-1，最大值出現(xiàn)在2塘5月份，最小值出現(xiàn)在1塘12月份，總體上看2塘異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量最高，平均為9.8×103cfu·mL-1，4塘最低，平均為1.3×103cfu·mL-1。圖4-B所示，各養(yǎng)殖塘青蛤腔液中弧菌數(shù)量變化范圍為0～2.1×103cfu·mL-1，最大值出現(xiàn)在2塘6月份，最小值出現(xiàn)在1塘5月份，總體上看2塘弧菌數(shù)量最高，平均為387.5 cfu·mL-1，4塘最低，平均為75 cfu·mL-1。方差分析顯示，不同采樣時(shí)間同一塘的青蛤腔液異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)差異極顯著(F=4.203，P<0.01)，5月和6月份樣品與其他月份青蛤腔液中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)差異顯著；不同采樣時(shí)間弧菌數(shù)量差異較為顯著(F=2.881，P<0.05)，5月與其他月份青蛤腔液中弧菌數(shù)量差異顯著。Pearson相關(guān)性分析顯示青蛤腔液異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)與養(yǎng)殖密度相關(guān)性極顯著(r=-0.189，P<0.01)，弧菌數(shù)量與養(yǎng)殖密度相關(guān)性極顯著(r=-0.123，P<0.01)。

圖2 不同月份各養(yǎng)殖塘底泥中異養(yǎng)細(xì)菌(A)和弧菌(B)數(shù)量的變動(dòng)Fig.2 The change trend of total heterotrophic bacteria (A) and the Vibrio (B) number in sediment for all ponds

圖3 同一養(yǎng)殖塘水樣、底泥中的異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)和弧菌數(shù)量變化Fig.3 The change trend of total heterotrophic bacteria and the Vibrio number in each ponds

3 討論

養(yǎng)殖塘異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量變動(dòng)與養(yǎng)殖塘中有機(jī)質(zhì)、浮游生物、溫度、及水體營(yíng)養(yǎng)鹽狀況等密切相關(guān)，是養(yǎng)殖塘物理、化學(xué)和生物因子綜合作用的結(jié)果。由于異養(yǎng)細(xì)菌是典型的基質(zhì)限制性生物，其個(gè)體微小、繁殖速度快、生命周期短，因而養(yǎng)殖塘的理化及生物因子的變動(dòng)容易對(duì)異養(yǎng)細(xì)菌產(chǎn)生影響。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)南美白對(duì)蝦[11-12]、大黃魚(yú)[13-15]、九孔鮑[16]、海參[17-18]、牡蠣[19]等海水養(yǎng)殖動(dòng)物及其養(yǎng)殖水體、沉積物中的異養(yǎng)細(xì)菌及其菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，因養(yǎng)殖環(huán)境不同其相應(yīng)環(huán)境水體中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量亦有差異。本研究中青蛤養(yǎng)殖塘水體中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的變化范圍為(0.025～57.5)×104cfu·mL-1，與仿刺參、牡蠣養(yǎng)殖水體中的異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)變化范圍基本一致[16，19]；青蛤養(yǎng)殖塘底泥中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)變化范圍為1.3×103～1.3×105cfu·mL-1，低于明顯低于對(duì)蝦圍塘底泥中總細(xì)菌數(shù)[20-21]，后者采用吖啶澄染色熒光顯微直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)樣品中的細(xì)菌總數(shù)，本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)，不包含環(huán)境中非可培養(yǎng)細(xì)菌。

圖4 不同月份各養(yǎng)殖塘青蛤腔液中異養(yǎng)細(xì)菌(A)和弧菌(B)數(shù)量變動(dòng)Fig.4 The change trend of total heterotrophic bacteria (A)and the Vibrio (B) number in Cyclina sinensis cavity fluid for all ponds

隨著近年來(lái)青蛤養(yǎng)殖技術(shù)的成熟，青蛤養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度也不斷增加，然而養(yǎng)殖密度過(guò)高必然會(huì)帶來(lái)一系列的養(yǎng)殖問(wèn)題，故探索適宜的養(yǎng)殖密度是青蛤海水圍塘生態(tài)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的必然選擇。本研究監(jiān)測(cè)檢測(cè)了不同密度養(yǎng)殖塘水體和底泥中弧菌的數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)水體和底泥中弧菌數(shù)量的變化與樣品中異養(yǎng)細(xì)菌總菌的變化顯著相關(guān)，水體中弧菌數(shù)量與養(yǎng)殖密度呈負(fù)相關(guān)而底泥中弧菌數(shù)量與養(yǎng)殖密度呈正相關(guān)，這與貝類強(qiáng)大的濾水能力和生物沉降作用有關(guān)。另外，水體中的異養(yǎng)菌總數(shù)和弧菌數(shù)量受季節(jié)影響較大，在夏秋高溫季節(jié)水體中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)明顯增高，這主要是受水溫影響，而底泥中的異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌數(shù)量則受營(yíng)養(yǎng)鹽累積的影響較大。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)牡蠣養(yǎng)殖水體的異養(yǎng)細(xì)菌及弧菌變化趨勢(shì)與體腔液中變化一致，只是降了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，本試驗(yàn)監(jiān)測(cè)檢測(cè)了青蛤腔液中異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)和弧菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)二者與青蛤養(yǎng)殖密度呈顯著負(fù)相關(guān)，與養(yǎng)殖水體中的菌數(shù)變化趨勢(shì)一致且降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。養(yǎng)殖貝類的微生物性疾病研究表明，青蛤發(fā)生細(xì)菌性疾病可能由多種弧菌共同感染所致，而養(yǎng)殖環(huán)境的改變?nèi)菀字率够【罅糠敝?，引起疾病的發(fā)生和蔓延[22-23]。

隨著我國(guó)淺海和灘涂貝類養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，貝類養(yǎng)殖環(huán)境惡化，易致使病害發(fā)生，而由于貝類底棲埋棲的生活特性，容易造成病害的大面積蔓延而且會(huì)進(jìn)一步破壞底質(zhì)，因而對(duì)貝類養(yǎng)殖環(huán)境的監(jiān)測(cè)不僅有利于了解貝類生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)環(huán)境的改變而且有利于掌握貝類生長(zhǎng)適宜的環(huán)境條件。本研究發(fā)現(xiàn)，青蛤養(yǎng)殖密度對(duì)養(yǎng)殖塘底泥、水體中的異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)和弧菌數(shù)量變化無(wú)顯著影響，而與青蛤腔液中異養(yǎng)菌數(shù)和弧菌數(shù)量變化相關(guān)性極顯著，表明高密度養(yǎng)殖雖然短期內(nèi)對(duì)水體和底泥菌群變化影響不大卻會(huì)影響青蛤的健康生長(zhǎng)。另外，經(jīng)過(guò)有效指導(dǎo)和合理管理，在青蛤養(yǎng)殖過(guò)程中試驗(yàn)塘未有病害發(fā)生，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)選取青蛤養(yǎng)殖密度都在養(yǎng)殖環(huán)境容量之內(nèi)。青蛤養(yǎng)殖密度適宜，加強(qiáng)管理，加大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)注重生態(tài)狀況，可推動(dòng)青蛤養(yǎng)殖業(yè)更加健康有序發(fā)展。