張洪飛 閆加鵬 韓桂全

【摘 要】目的：探索VEGF-2578C/A，936C/T和-460T / C基因多態(tài)性在骨肉瘤發(fā)展過程中的表達水平，從而研究二者可能存在的先關性。方法：將我院自2014年1月至2017年01月的90例骨肉瘤患者和90例健康對照組成員納入本研究進行基因多態(tài)性的對比分析。結果：對照組的VEGF-2578C/A和-460T / C基因型頻率符合哈迪-溫伯格平衡參數(shù)，但936C/T基因型頻率并不在此范圍內。骨肉瘤患者-2578C/A 的AA基因型（OR = 1.90；95%可信區(qū)間 = 1.00-3.78）和CA+AA基因型（OR = 1.53；95%可信區(qū)間 = 1.00-2.25）相對于CC基因型而言是顯著增加的。結論：-2578C/A的AA基因型與CA+AA 基因型提高了骨肉瘤的患病率。

【關鍵詞】血管內皮生長因子；基因多態(tài)性；骨肉瘤

【中圖分類號】R181.3+2 【文獻標志碼】

A

【文章編號】1005-0019（2018）11-065-01

骨肉瘤來源于間葉組織，好發(fā)于長干骨如股骨遠端、脛骨和肱骨的骨骺端。骨肉瘤多見于兒童和青少年，約有3 / 1000000的發(fā)病率[1]。骨肉瘤的發(fā)展是個復雜的、多步驟的、多因素參與的過程[2]，腫瘤干細胞及其潛在性導致了腫瘤的發(fā)生，這也提示遺傳因素在骨肉瘤的發(fā)展過程中起著重要的作用[3、4]。研究證實，腫瘤的潛在侵襲性與血管內皮細胞中新生的血管有關[5、6]，血管內皮生長因子及新生血管的形成是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個基本步驟[7]。血管內皮生長因子（VEGF）是一種強效的促血管生長因子，VEGF的多態(tài)性可以通過改變內部的轉錄和翻譯來影響該基因的表達[8]，一些單核苷酸多態(tài)性比如-2578C/A、936C/T和460T/C被證實可以影響VEGF蛋白的合成。越來越多的研究證實VEGF多態(tài)性和腫瘤之間的關聯(lián)性[9-11]，但目前只有兩個研究報道了VEGF基因與骨肉瘤患病風險性之間的關聯(lián)[12、13]。本研究旨在探索VEGF-2578C/A， +936C/T 和-460T/C基因多態(tài)性在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中表達水平的變化。

研究方法

研究人群：本課題將濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院自2014年1月至2017年01月的90例骨肉瘤患者和90例年齡和性別無差異的健康對照組成員納入本研究進行研究分析。所有的骨肉瘤患者都是初次患病，由兩位病理學醫(yī)生分別進行了確診，從臨床和病理兩方面來獲取骨肉瘤患者資料，其中包括性別、年齡、腫瘤分期、腫瘤部位、腫瘤轉移和腫瘤家族史。對照組成員為我院健康體檢的志愿者，均為非骨肉瘤患者，且自身沒有任何癌癥病史，無一級親屬骨肉瘤患病家族史。本研究方案經由濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準通過，根據赫爾辛基宣言對所有參與者簽署書面知情同意書。

研究方法：用DNA提取試劑盒從外周血白細胞中提取DNA，PCR-RFLP法來研究VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C基因多態(tài)性表達差異。通過分子檢測3.1軟件來為VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C設計PCR引物。PCR反應的步驟如下：在Perkin-Elmer 9700的熱循環(huán)儀里進行94°C下8分鐘的初始變性，然后在94°C下 30秒內進行30個周期變性，在60°C退火30秒，在72°C 下進行1分鐘延伸。PCR產物被NlaIII限制性內切酶（紐英倫公司，貝弗利，MA）進行酶解。由此產生的DNA片段，經3.5%瓊脂糖凝膠下進行電泳，經過ethidum染色，在可視化的紫外線照射下透視。

使用SPSS 16版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，連續(xù)變量之間的差異采用t檢驗評估，分類變量之間均采用皮爾遜x2檢驗來評估。對照組中VEGF-2578C/A，+936C/T 和 -460T/C基因多態(tài)性的哈代-溫伯格均衡參數(shù)用皮爾遜x2檢驗。組間的基因型頻率存在的差異則用皮爾遜x2檢驗手段、比值比（OR）和95%可信區(qū)間（CI）來評估。P值<0.05具有顯著統(tǒng)計學差異。

結果

骨肉瘤患者和對照組的特性如表1所示，實驗組和對照組之間在年齡（P = 0.69）、性別（P = 1）、腫瘤家族史（P = 0.44）方面無統(tǒng)計學差異，其中骨肉瘤組平均年齡為21.3±11.5歲，對照組平均年齡為21.2±11.9歲。實驗組中68.89%的骨肉瘤發(fā)生在長管狀骨，其余31.11%位于軀干中軸骨骼；38.89%的骨肉瘤組患者出現(xiàn)腫瘤轉移，其余的61.11%患者未發(fā)生轉移。對照組的VEGF-2578C/A和460T/C基因頻率在哈迪-溫伯格平衡參數(shù)內，但936C/T基因型頻率不在哈迪-溫伯格平衡參數(shù)內（表2）。對照組中的VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C的次要等位基因頻率（MAF）與中國大眾人口NCBI數(shù)據庫中的相一致。同-2578C/A的 CC基因亞型相比，-2578C/A 的AA基因型（OR = 1.90；95%可信區(qū)間 = 1.00-3.78）和CA+AA基因型（OR = 1.53；95%可信區(qū)間 = 1.00-2.25）在骨肉瘤風險中是顯著增加的（表3） 。+936C/T和-460T / C基因多態(tài)性與骨肉瘤風險之間的關聯(lián)性并沒有顯著的意義。

討論

遺傳因素和某些導致DNA損傷的環(huán)境因素與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展有關[14]，VEGF基因被認為是其中的一個重要遺傳因素[12、13]。本研究旨在探索VEGF基因多態(tài)性與中國人口中骨肉瘤風險之間的關聯(lián)性，證實了-2578C/A的AA基因型和CA+AA基因型與骨肉瘤風險增加有關。新的血管生成在腫瘤的發(fā)生和轉移過程中起著重要作用，而血管內皮生長因子是血管生成的關鍵因子，它能促進內皮細胞增殖和改變血管細胞外基質[15]。研究證實，在多種腫瘤中都有血管內皮生長因子的高度表達，并且它與促進腫瘤組織血管密度呈正相關[16]。血管內皮生長因子的基因多態(tài)性被證實與乳腺癌、肺癌、大腸癌、胃癌和前列腺癌等多種腫瘤的敏感性有關。目前僅有兩個針對VEGF基因多態(tài)性與骨肉瘤風險性之間關聯(lián)性的研究，Tie[12]將單核苷酸與骨肉瘤的患病率之間相關性進行了研究分析，證實了VEGF-2578C/A和-634G / C的多態(tài)性可能增加骨肉瘤患病率。Wang[13]等人發(fā)現(xiàn)VEGF基因中的三個常見單核苷酸多態(tài)性對于骨肉瘤的敏感性有著潛在影響，認為-634G/C 的T等位基因可能與中國人群的骨肉瘤多態(tài)性有關，但這都需要進一步的研究來證實。

本研究證實VEGF -2578C/A的AA和CA基因亞型可能增加了中國人群中骨肉瘤的患病率，血管生長因子在骨肉瘤病因學中起著重要的作用。

參考文獻

[1] Mirabello L， Troisi RJ， Savage SA （2009）. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004： Data from the surveillance， epidemiology， and end results program. Cancer. 115：1531-1543.

[2] Powers M， Zhang W， Lopez-Terrada D， Czerniak BA， Lazar AJ （2010）. The molecular pathology of sarcomas. Cancer biomarkers： section A of Disease markers. 9：475-491.