俞嬌　施永勝　郭閃閃

[摘要] 目的 分析胸水細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)在肺腺癌中的應(yīng)用。 方法 收集東陽(yáng)市中醫(yī)院2008年6月～2015年12月7年間50例可疑惡性胸水樣本，分析其臨床病史、涂片、細(xì)胞蠟塊切片、免疫組織化學(xué)及基因檢測(cè)等資料。 結(jié)果 50例可疑惡性胸水患者，增生反應(yīng)性間皮細(xì)胞4例，確診惡性腫瘤46例，其中肺腺癌27例，其他組織來(lái)源及組織類(lèi)型19例，與細(xì)胞學(xué)常規(guī)涂片相比，細(xì)胞蠟塊切片鏡下可見(jiàn)背景干凈，染色對(duì)比清晰，細(xì)胞數(shù)目明顯增多、厚薄均勻，且可以尋找組織來(lái)源及基因檢測(cè)。 結(jié)論 細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)技術(shù)極大地提高了胸水細(xì)胞學(xué)的診斷準(zhǔn)確率及明確組織來(lái)源；同時(shí)為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療提供了平臺(tái)，值得推廣。

[關(guān)鍵詞] 胸水；免疫組織化學(xué)；腺癌；細(xì)胞塊

[中圖分類(lèi)號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）19-0135-04

Application of pleural effusion cell wax block combined with immunohistochemistry in advanced lung adenocarcinoma

YU Jiao1 SHI Yongsheng1 GUO Shanshan1 CHEN Yan2

1.Department of Pathology， Dongyang Traditional Chinese Medicine Hospital， Dongyang 322100， China； 2.Department of Pathology， Dongyang People's Hospital， Dongyang 322100， China

[Abstract] Objective To analyze the application of pleural effusion cell wax block combined with immunohistochemistry in lung adenocarcinoma. Methods 50 cases of suspected malignant pleural effusion from June 2008 to December 2015 were collected from Dongyang Traditional Chinese Hospital. The clinical history， smears， cell wax block， immunohistochemistry and gene detection were analyzed. Results There were 4 cases of proliferative reactive mesothelial cells and 46 cases of diagnosed malignant tumors in 50 cases of suspected malignant pleural effusion. Among them， 27 cases were lung adenocarcinoma and 19 cases were from other tissue sources and tissue types. Compared with that of cytological routine smears， the background of cell wax block was clean under the microscope， and the staining contrast was clear； the number of cells was obviously increased； the thickness was even； the tissue source and gene detection could be found. Conclusion The cell wax immunohistochemistry technique greatly improves the diagnostic accuracy of pleural effusion cytology and clarifies the source of tissue. At the same time， it provides a platform for accurate tumor treatment and is worthy of promotion.

[Key words] Pleural effusion； Immunohistochemistry； Adenocarcinoma； Cell mass

胸水細(xì)胞學(xué)樣本具有可多次重復(fù)取得、損傷小、檢查時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，在臨床實(shí)際工作中較廣泛應(yīng)用于中晚期惡性腫瘤的檢查，而普通胸水細(xì)胞學(xué)涂片很難為臨床醫(yī)師提供惡性腫瘤的發(fā)病部位、腫瘤的病理組織學(xué)類(lèi)型、預(yù)測(cè)預(yù)后以及與治療相關(guān)有價(jià)值的信息，甚至部分患者難以明確診斷。近年來(lái)隨著腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的不斷深入，應(yīng)用組織病理學(xué)樣本進(jìn)行腫瘤基因或免疫組織化學(xué)腫瘤蛋白表達(dá)的檢測(cè)，已成為指導(dǎo)臨床靶向治療或預(yù)測(cè)化療藥物療效的最可靠方法之一，近年來(lái)特別是肺腺癌尤其有臨床指導(dǎo)意義，但對(duì)于晚期肺腺癌患者，常不容易取得組織病理學(xué)樣本，相較而言胸水細(xì)胞學(xué)樣本常較容易獲得，肺腺癌是導(dǎo)致惡性胸水的最常見(jiàn)原因之一，因此利用胸水細(xì)胞學(xué)樣本進(jìn)行相應(yīng)的細(xì)胞蠟塊診斷及基因檢測(cè)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)，對(duì)肺腺癌的診斷、指導(dǎo)臨床治療和預(yù)后具有重要意義。本文報(bào)告東陽(yáng)市中醫(yī)院病理科應(yīng)用胸水細(xì)胞學(xué)樣本制作細(xì)胞蠟塊，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色、對(duì)確診的晚期肺腺癌患者進(jìn)行治療與預(yù)后相關(guān)的基因檢測(cè)，探討胸水細(xì)胞學(xué)樣本制作細(xì)胞蠟塊行免疫組織化學(xué)檢測(cè)在確定腫瘤組織的來(lái)源、腫瘤組織具體類(lèi)型及肺腺癌患者的治療及預(yù)后的相關(guān)基因檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集東陽(yáng)市中醫(yī)院2008年6月～2015年12月7年間病理科歸檔具有常規(guī)涂片及細(xì)胞蠟塊資料的可疑惡性胸水細(xì)胞學(xué)樣本共50例，收集臨床病史、涂片、細(xì)胞蠟塊切片、免疫組織化學(xué)及基因檢測(cè)等資料，其中男29例，女21例，年齡40～79歲，平均（51.0±7.5）歲。

1.2 脫落細(xì)胞常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片

送檢的新鮮胸水細(xì)胞學(xué)樣本100 mL靜置15 min后，倒去上部清亮液體；取10～20 mL瓶底沉渣置于試管2500～3000轉(zhuǎn)/min離心5 min后，將上清液倒去；將剩余細(xì)胞學(xué)沉渣樣物0.5～1 mL用滴管混勻；用滴管吸取混勻的沉淀物滴在載玻片上，均勻涂片后在半潮干狀態(tài)下用4%甲醛固定10～30 min后常規(guī)蘇木素-伊紅染色；顯微鏡下仔細(xì)觀(guān)察。

1.3 細(xì)胞蠟塊操作方法

將胸水脫落細(xì)胞學(xué)樣本常規(guī)涂片細(xì)胞學(xué)檢查剩余的細(xì)胞學(xué)樣本移入20～50 mL離心管，2500～3000 轉(zhuǎn)/min，離心10 min，離心沉渣量太少的樣本移出上清液，多次重復(fù)加入細(xì)胞學(xué)樣本并離心，直到離心沉渣符合制作細(xì)胞蠟塊要求。離心管內(nèi)保留上清液1.5～2.5 mL，輕輕混勻，移入專(zhuān)用離心管，色澤較淺的標(biāo)本可適當(dāng)?shù)渭右良t試劑染色，靜置10 min后，放入水平式離心機(jī)1500～2000 轉(zhuǎn)/min，離心5 min（血性細(xì)胞學(xué)樣本，去除紅細(xì)胞后的離心沉渣仍含有較多血紅蛋白，需將離心時(shí)間延長(zhǎng)1倍）；取出細(xì)胞塊收集環(huán)，細(xì)胞混懸液中的細(xì)胞成分被收集至細(xì)胞塊收集環(huán)中，形成固定大小形狀的固體細(xì)胞塊，從上部滴加1～2滴瓊脂液（已加熱至50℃～60℃），室溫冷卻，連同收集環(huán)用脫水紙包裹后放入脫水盒，4%中性甲醛固定液固定6～8 h以上，即可進(jìn)入脫水機(jī)常規(guī)脫水處理，常規(guī)脫水、透明、浸蠟后包埋，切片行蘇木素-伊紅染色，免疫組織化學(xué)染色等。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)的選擇

根據(jù)胸水脫落細(xì)胞學(xué)涂片和胸水細(xì)胞蠟塊石蠟切片顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞學(xué)及細(xì)胞蠟塊形態(tài)學(xué)及臨床相關(guān)資料選擇免疫組織化學(xué)抗體，對(duì)于臨床及影像學(xué)可疑肺癌的患者，常規(guī)選擇AE1/AE3、TTF1、NapsinA、CK7、CK5/6、P63、P40、CEA作為肺癌抗體、選擇Calretinin、MC、D2-40、Vimentin作為間皮抗體。以上抗體均購(gòu)置上海基因科技有限公司。

1.5 免疫組織化學(xué)

EnVision二步法，胸水細(xì)胞蠟塊石蠟切片，脫蠟至水，高壓抗原修復(fù)10 min，冷卻至室溫，充分水洗，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸洗，3 min×3次；去除多余液體，加AE1/AE3、TTF1、NapsinA、CK7、CK5/6、P63、P40、CEA、Calretinin、MC、D2-40、Vimentin等一抗抗體，PBS浸洗，3 min×3次；去除多余液體，滴加通用型二抗-HRP聚合物，37℃，30 min；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色2 min，在顯微鏡下觀(guān)察顯色情況，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸酒精分化，PBS沖洗返藍(lán)，乙醇脫水、透明、中性樹(shù)膠封固。

1.6 免疫組織化學(xué)判讀

根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)定和分析，綜合考慮陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度來(lái)判定結(jié)果，將其中（-）歸為陰性表達(dá)，（+）～（+++）歸為陽(yáng)性表達(dá)。

1.7 肺腺癌治療與預(yù)后相關(guān)基因檢測(cè)

對(duì)于經(jīng)臨床病史及免疫組織化學(xué)確診肺腺癌27例中18例送杭州迪安醫(yī)學(xué)檢測(cè)中心進(jìn)行表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞學(xué)涂片

腺癌細(xì)胞明顯異型，多形性，核漿比高，核膜厚、不規(guī)則，核深染，染色質(zhì)粗塊狀，核仁大，有較強(qiáng)的三維立體結(jié)構(gòu)。50例可疑惡性胸水，11例診斷見(jiàn)退變異型細(xì)胞，無(wú)法明確性質(zhì)，39例診斷見(jiàn)惡性腫瘤細(xì)胞，其中15例傾向腺癌，24例組織類(lèi)型難定。

2.2細(xì)胞蠟塊

50例可疑惡性胸水患者，增生反應(yīng)性間皮細(xì)胞4例，確診惡性腫瘤46例，其中肺腺癌27例，其他組織來(lái)源及組織類(lèi)型19例，與細(xì)胞學(xué)涂片相比，細(xì)胞蠟塊制片鏡下觀(guān)察顯示背景干凈，染色對(duì)比清晰，細(xì)胞數(shù)目明顯富集、厚薄均勻，且在多數(shù)病例中可觀(guān)察到細(xì)胞的排列方式及組織學(xué)結(jié)構(gòu)可見(jiàn)中空的腺樣、囊泡狀、梁索一乳頭狀或片狀排列的細(xì)胞。見(jiàn)封三圖5。

2.3 免疫表型

綜合HE染色的細(xì)胞學(xué)涂片、細(xì)胞塊切片及臨床資料，不同的病例選用不同的抗體。肺腺癌病例中CK7、TTF1、NapsinA、CEA至少有兩項(xiàng)以上陽(yáng)性，且Calretinin、CK5/6、D2-40、Vimentin均陰性。見(jiàn)封三圖6。

2.4 表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）檢測(cè)

27例肺腺癌送檢18例，其中5例有表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）突變，突變率27.8%。

3 討論

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，也是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。相當(dāng)數(shù)量的晚期肺癌患者來(lái)院就診的首發(fā)癥狀為大量惡性胸腔積液，因此對(duì)于一些通過(guò)臨床多種影像學(xué)檢查等手段均無(wú)法明確肺癌診斷的患者在指導(dǎo)治療、預(yù)測(cè)預(yù)后等方面非常重要。在所有肺癌胸腔轉(zhuǎn)移患者中，絕大多數(shù)為肺腺癌所致。傳統(tǒng)的胸腔積液檢查方法是收集胸腔積液行常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片，顯微鏡下僅憑借細(xì)胞形態(tài)學(xué)查找腫瘤細(xì)胞，但有時(shí)因涂片質(zhì)量欠佳，腫瘤細(xì)胞量少，涂片背景血細(xì)胞過(guò)多，且腫瘤細(xì)胞異型性不明顯或腫瘤細(xì)胞不典型，增生反應(yīng)性間皮細(xì)胞和轉(zhuǎn)移的肺腺癌細(xì)胞形態(tài)極為相似時(shí)，易導(dǎo)致腫瘤的誤診或漏診[2]。臨床實(shí)際工作中，鑒別肺轉(zhuǎn)移性腫瘤和間皮性病變具有較大意義，特別是鑒別肺腺癌和惡性間皮瘤常直接影響治療方案的制定[3]。細(xì)胞蠟塊因?qū)⑹占募?xì)胞學(xué)樣本做成細(xì)胞塊石蠟切片而具有組織學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)用于免疫組織化學(xué)研究胸腔積液不僅有利于明確診斷且可以查找腫瘤原發(fā)灶及組織類(lèi)型[4]。張小偉等[5]利用42例惡性漿膜腔積液標(biāo)本制作細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)檢查明確組織類(lèi)型及腫瘤原發(fā)病灶40例，其中肺癌29例（腺癌24例、鱗癌3例、小細(xì)胞癌2例），其他組織類(lèi)型及組織來(lái)源惡性腫瘤11例。閻紅琳等[6]分析53例可疑惡性漿膜腔積液樣體制作細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)最終明確診斷惡性腫瘤50例，其中肺腺癌31例，消化道腺癌3例，乳腺癌2例，卵巢、輸卵管及腹膜3例，肺鱗狀細(xì)胞癌2例，其他惡性腫瘤9例。本組研究根據(jù)臨床提供的患者病史，選擇不同的免疫組織化學(xué)抗體組合，對(duì)50例可疑惡性胸腔積液樣本進(jìn)行標(biāo)記，確診增生反應(yīng)性間皮細(xì)胞4例，確診惡性腫瘤46例，其中肺腺癌27例，其他組織來(lái)源及組織類(lèi)型19例。肺腺癌CK7、TTF1、NapsinA、CEA至少有兩項(xiàng)以上陽(yáng)性，且Calretinin、CK5/6、D2-40、Vimentin均陰性，TTF1及NapsinA在診斷肺腺癌有具有較好的敏感性和特異性[7-8]。羅巧明等[9]研究認(rèn)為聯(lián)合檢測(cè)TTF-1、CA125、CK7、CK20能有效鑒別漿膜腔積液中來(lái)自肺、卵巢、胃腸道的腺癌。

腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療己逐漸成為肺腺癌治療的新方向[10]，近年來(lái)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）為肺腺癌患者的治療帶來(lái)了新的靶向治療手段，研究發(fā)現(xiàn)用吉非替尼治療后的晚期肺腺癌患者的生存期明顯延長(zhǎng)，但用藥前必須進(jìn)行表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）的突變檢測(cè)[11-13]。對(duì)穿刺活檢獲取組織病理學(xué)樣本進(jìn)行突變檢測(cè)困難，但又迫切希望進(jìn)行個(gè)體化治療的晚期肺腺癌患者，胸腔積液細(xì)胞蠟塊可作為一種較好的且可能是唯一的檢測(cè)樣本來(lái)源[14]。沈湘萍等[15]分析45例疑似惡性胸腔積液樣本進(jìn)行制作細(xì)胞蠟塊切片發(fā)現(xiàn)胸腔積液沉渣包埋切片及免疫組織化學(xué)可作為惡性胸腔積液診斷的重要手段，并可為臨床尋找和判斷惡性腫瘤細(xì)胞組織來(lái)源及組織類(lèi)型提供幫助。張麗華等[16]分析64例惡性細(xì)胞學(xué)樣本發(fā)現(xiàn)利用細(xì)胞學(xué)剩余樣本制備細(xì)胞蠟塊，結(jié)合免疫組織化學(xué)標(biāo)記物和基因檢測(cè)技術(shù)有助于晚期惡性腫瘤的診斷，并為個(gè)體化治療方案的選擇提供可靠依據(jù)。本組研究中27例肺腺癌送檢表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）檢測(cè)18例，其中有表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因突變5例，突變率27.8%，與以往文獻(xiàn)報(bào)道相近[17-18]。

總之，細(xì)胞蠟塊免疫組織化學(xué)技術(shù)極大地提高了胸水細(xì)胞學(xué)的診斷準(zhǔn)確率；同時(shí)為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療提供了平臺(tái)，值得推廣[19]。惡性胸水細(xì)胞塊行免疫組織化學(xué)檢測(cè)不僅有助于腫瘤的明確診斷，更有助于對(duì)腫瘤進(jìn)行分類(lèi)并判斷腫瘤原發(fā)部位及幫助判斷預(yù)后，利用胸水細(xì)胞蠟塊可以對(duì)肺腺癌進(jìn)行表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因突變的檢測(cè)，為肺腺癌的基因檢測(cè)提供新型的樣本來(lái)源[20]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 支修益，石遠(yuǎn)凱，于金明.中國(guó)原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2015年版）[J].中華腫瘤雜志，2015，37（1）：67-68.

[2] 虞紅珍，吳強(qiáng).漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢查中制片技術(shù)應(yīng)用的現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2014，30（4）：434-436.

[3] 尹艷華，李玉紅，張杰.胸腔積液細(xì)胞學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)在鑒別肺轉(zhuǎn)移性腺癌和間皮細(xì)胞中的臨床價(jià)值分析[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2007，15（9）：1253-1254.

[4] 王文軍，張偉，陳玉娟，等.細(xì)胞蠟塊免疫標(biāo)記在漿膜腔積液腺癌細(xì)胞病理學(xué)診斷中的臨床價(jià)值[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，45（4）：288-290.

[5] 張小偉，黃必飛，陳艷，等.細(xì)胞塊技術(shù)在惡性漿膜腔積液組織來(lái)源及分子病理檢測(cè)中的應(yīng)用[J].浙江醫(yī)學(xué)，2015，37（23）：1891-1894.

[6] 閻紅琳，袁靜萍，劉琳，等.細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)在漿膜腔積液病理診斷中的應(yīng)用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2016，32（12）：1414-1415.

[7] 權(quán)春姬.組合性抗體在肺癌所致漿膜腔積液細(xì)胞蠟塊中的應(yīng)用[J].實(shí)用醫(yī)技雜志，2017，24（1）：98-100.

[8] 毛渭東，賀丹丹，何洪偉，等.免疫組織化學(xué)標(biāo)記在惡性漿膜腔積液診斷中的應(yīng)用價(jià)值探討[J].診斷病理學(xué)雜志，2015，22（10）：634-636.

[9] 羅巧明，江鶴靈，張建.免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢查協(xié)助鑒別漿膜腔積液中轉(zhuǎn)移性腺癌原發(fā)部位[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2012，20（4）：822-824.

[10] 蘇暄.基因檢測(cè)掀開(kāi)精準(zhǔn)醫(yī)療帷幕，帶來(lái)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顛覆性革命[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2015，5（4）：1-6.

[11] 程世釗，張遜.精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代下非小細(xì)胞肺癌研究的現(xiàn)狀與展望[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2015，32（8）：1769-1771.

[12] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)肺癌學(xué)組，中國(guó)肺癌防治聯(lián)盟.晚期非小細(xì)胞肺癌分子靶向治療專(zhuān)家共識(shí)（2013版）[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2014，37（3）：177-183.

[13] 吳一龍，楊衿記，林嘉穎，等.吉非替尼靶向治療非小細(xì)胞肺癌的臨床研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2007，30（2）：98-102.

[14] 魏冰，馬杰，馬智勇，等.肺腺癌患者惡性胸腔積液中EGFR突變狀況分析[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012， 28（3）：323-326.

[15] 沈湘萍，陳艷.45例胸腔積液細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)在細(xì)胞學(xué)診斷中的應(yīng)用[J].浙江實(shí)用醫(yī)學(xué)，2014， 19（4）：264-266.

[16] 張麗華，王雪晴，王國(guó)慶，等.細(xì)胞蠟塊在晚期腺癌診斷和肺腺癌個(gè)體化治療中的應(yīng)用價(jià)值[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2014，30（2）：166-170.

[17] 孟加榕，潘羨心，郭以河.肺腺癌胸腔積液上清液和細(xì)胞塊EGFR基因突變檢測(cè)的臨床意義[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2014，26（10）：82-85.

[18] 丁麗，張萍，武曉楠，等.非小細(xì)胞肺癌患者胸腔積液腫瘤細(xì)胞EGFR基因突變檢測(cè)及其在治療中的價(jià)值[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（1）：1-4.

[19] 楊新，王秋實(shí)，李艷青，等.細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)有效提高胸水細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性檢出率的臨床研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，22（12）：2894-2897.

[20] 隋燕霞，柳雨，蔣娜，等.142例惡性胸水細(xì)胞蠟塊的免疫組織化學(xué)檢測(cè)及分子病理檢測(cè)[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2017，33（3）：292-296.

（收稿日期：2017-10-18）