王 娟，喬自林,2，馮玉萍

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030)

新生牛血清(Nnewborn Calf Serum，NBCS)為細胞增殖和維持生長提供所需的營養(yǎng)成分和生物因子，是動物細胞培養(yǎng)的重要原輔材料[1].體外培養(yǎng)的動物細胞需要添加一定量的NBCS才能維持其生長.不同細胞系對NBCS的需求量可能不同，量加多了造成浪費，量加少或不足會影響生長.VERO細胞通常培養(yǎng)時添加10%NBCS(v/v).在IPV疫苗的生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)5%NBCS就滿足生產(chǎn)需要，節(jié)約了生產(chǎn)成本.由于NBCS來源有限且價格很高，確定其在細胞培養(yǎng)階段最經(jīng)濟有效的添加量是生物制品大規(guī)模生產(chǎn)工藝研究的重要內(nèi)容.MDCK細胞系(Madin-Darby canine kidney cell line，MDCK)是從犬腎組織中分離培養(yǎng)獲得的上皮樣貼壁細胞，該細胞可用于多種病毒的繁殖和純化.近年來，大量圍繞MDCK細胞系替代雞胚用于流感及禽流感病毒的監(jiān)測、研究及疫苗生產(chǎn)的研究有了突破，為細胞基質(zhì)的新型流感疫苗的開發(fā)提供了理論支持，MDCK細胞的流感疫苗是大勢所趨[2-5].細胞的貼壁率是分析細胞增殖和存活的重要指標之一，在動物細胞培養(yǎng)技術(shù)中廣泛應(yīng)用.任何細胞被置于體外時，對細胞培養(yǎng)環(huán)境有一個適應(yīng)過程，其間細胞對培養(yǎng)液具有同化作用，而單細胞的同化能力不如群體細胞強.細胞低密度接種培養(yǎng)相當(dāng)于給細胞人為地降低了群體效應(yīng)或同化能力，實驗結(jié)果更加真實地反映出細胞對培養(yǎng)液的適應(yīng)情況.文章研究了不同濃度NBCS對低密度培養(yǎng)MDCK細胞的集落數(shù)和貼壁率，為該細胞的大規(guī)模培養(yǎng)提供參考.

1 材料與方法

1.1 MDCK細胞

P70，(由甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心提供)；新生牛血清(NBS，蘭州民海生物工程有限公司，批號：20161024)；0.25%胰蛋白酶(蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，批號：20170115)；DMEM培養(yǎng)基(蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，批號：20161126).其他試劑：PBS磷酸緩沖液、固定液、臺盼藍染液、結(jié)晶紫染液等.

1.2 細胞復(fù)蘇及活力測定

按常規(guī)方法復(fù)蘇MDCK細胞，檢查細胞活力達到90%以上時，用10% NBS(v/v)的DMEM培養(yǎng)基置培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2、飽和濕度，下同)中培養(yǎng).

1.3 細胞傳代適應(yīng)培養(yǎng)

待細胞生長至90%以上融合時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1∶4比例分別用含2%、5%、8%、10%NBCS的培養(yǎng)基相應(yīng)地傳代至3代備用.

1.4 細胞懸液的制備

0.25%胰蛋白酶分別消化細胞，用相應(yīng)濃度NBCS的培養(yǎng)基制備細胞懸液.采用有限稀釋法將細胞稀釋至1×103個/mL.

1.5 低密度接種培養(yǎng)

取上述細胞懸液，在6孔細胞培養(yǎng)板(面積9.6cm2/孔)上按10個細胞 /cm2接種培養(yǎng)，每孔培養(yǎng)液為3 mL，每個血清濃度平行做3孔.

1.6 觀察和計數(shù)

每2～3 d倒置相差顯微鏡觀察集落形成的情況.當(dāng)形成的集落能肉眼可見時，用結(jié)晶紫染色計數(shù)集落數(shù)目.

1.7 貼壁率的計算

依據(jù)下列公式計算細胞在不同培養(yǎng)基中的貼壁率.

貼壁率(%)=所形成的集落數(shù)目/接種的細胞數(shù)目×100%.

2 結(jié)果

2.1 細胞

復(fù)蘇后經(jīng)臺盼藍染色后記數(shù)，細胞活力達92.85%，細胞活力高、狀態(tài)好.

2.2 復(fù)蘇的細胞

48 h可生長較致密單層，用含2%、5%、8%、10%的新生牛血清(NBS)的培養(yǎng)基適應(yīng)培養(yǎng)時細胞生長狀態(tài)良好.1∶4比例傳代，10%NBS的生長最快、細胞狀態(tài)最好，8%NBS的次之.此兩種血清濃度下培養(yǎng)的MDCK細胞需要在48 h傳代；5%NBS和2%NBS相對較慢，72 h～84 h形成較致密單層.

2.3 低密度

接種培養(yǎng)后第三天鏡下可見有貼壁的細胞分裂成多個，形態(tài)不規(guī)則且細胞相互間隙較大.6 d已經(jīng)成小簇.簇的外觀還呈不規(guī)則，兩周基本形成了致密的肉眼可見的細胞大集落.集落數(shù)目和貼壁率見表1.

表1不同血清濃度下MDCK細胞集落形成數(shù)和貼壁率

3 結(jié)論與分析

評價細胞培養(yǎng)效果的方式很多，最常用的是細胞生長曲線、最大增殖濃度和倍增時間等，這都是在細胞接種較高、有群體效應(yīng)的情況下進行的.細胞低密度培養(yǎng)降低了群體效應(yīng)，實驗結(jié)果更加真實地反映出細胞對培養(yǎng)液的適應(yīng)情況.在GE公司提供的微載體培養(yǎng)手冊中介紹，細胞的貼壁率是指導(dǎo)細胞在微載體上接種數(shù)量的關(guān)鍵指標.因為只有貼壁效果好，細胞才能在攪拌懸浮狀態(tài)下貼壁生長.本文以低密度10個/cm2接種MDCK細胞培養(yǎng)，探究了2%、5%、8%、10%血清濃度對細胞培養(yǎng)的影響.在血清濃度為10% 時MDCK細胞貼壁率最高為74.89%，在血清濃度8%時貼壁率也達到了61%.表明該血清濃度下細胞貼壁生長效果很好，能用于生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng).