陸陳丹陽，錢永強(qiáng),2，王 越，孫振元,2

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091； 2.林木遺傳育種國家重點實驗室 中國林業(yè)科學(xué)研究院，北京 100091)

鹽分脅迫是世界上危害植物生長較嚴(yán)重的非生物脅迫因素之一[1]，其限制了植物的生長和作物產(chǎn)量[2]。目前，全球鹽漬化土地約9.55×108hm2，占全球陸地面積的10%[3]，其中次生鹽漬化土地約7.7×107hm2[4]，因鹽漬化而荒廢的土地在每年以1 000萬hm2的趨勢增長[5]。由于土地的不合理開發(fā)利用和生態(tài)環(huán)境的惡化，全球土壤鹽漬化面積仍在迅速增加[6-7]。在鹽漬化地區(qū)，植物長勢緩慢，種類單一，資源匱乏，嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展[8]。目前，植物對鹽脅迫的適應(yīng)性成為了土壤鹽漬化領(lǐng)域的研究熱點[9]。

克隆植物是一個在自然界中廣泛存在的植物類群，其特點是能夠通過與基株相連的根、芽、蘗、枝及匍匐莖等的營養(yǎng)生長，形成許多互相聯(lián)系的無性系分株[10-11]。在自然環(huán)境中，植物生長所需的資源(如光照、水分和養(yǎng)分等)在時空上分布極不均勻(資源異質(zhì)性)，克隆植物可以通過相連分株之間物質(zhì)和能量的交流與共享，實現(xiàn)克隆分株間的生理整合(physiological integration)，有效地緩解資源異質(zhì)性對生長和繁殖帶來的不利影響，從而使克隆植物能夠適應(yīng)異質(zhì)性惡劣環(huán)境，在生態(tài)系統(tǒng)更新、恢復(fù)過程中扮演重要的角色[12]。

蛇莓(Duchesneaindica)原產(chǎn)于中國，是一種典型的克隆植物，為薔薇科(Rosaceae)蛇莓屬(Duchesnea)的多年生草本植物[13]。該植物能夠產(chǎn)生較長的地上匍匐莖從而表現(xiàn)出克隆生長習(xí)性，匍匐莖在橫向生長一段時間后，其頂芽轉(zhuǎn)向上形成節(jié)間極度縮短的直立莖，直立莖基部產(chǎn)生許多不定根，從而形成分株[14]?？寺》种觊g的生理整合使其在資源貧瘠的異質(zhì)環(huán)境下表現(xiàn)出極強(qiáng)的空間拓展和生存競爭能力[15]。異質(zhì)性生境下野生草莓相連分株間資源交互傳輸，這種資源共享緩解了局部的資源缺乏，從而增強(qiáng)了遠(yuǎn)、近端克隆分株部分和克隆片段的生長[16]。近幾年對蛇莓的研究主要集中在其化學(xué)活性成分和藥理，以及小尺度克隆結(jié)構(gòu)和克隆構(gòu)型對不同環(huán)境(如海拔、土壤養(yǎng)分、水分)的可塑性響應(yīng)等方面[17-19]。但是關(guān)于蛇莓等克隆植物克隆生理整合的調(diào)控機(jī)理研究較少。本研究擬通過不同鹽濃度處理蛇莓姊妹株在連接與斷開狀態(tài)下生長與生理變化規(guī)律，揭示其生理整合特性對鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制，為克隆植物在逆境生理領(lǐng)域提供理論依據(jù)，也為蛇莓在貧瘠土地綠化提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

采用野生蛇莓作為試驗材料。通過多世代無性繁殖，獲得大量基因型完全一致的蛇莓分株，將單株分株作為母株栽至15 cm×15 cm花盆中，栽培基質(zhì)為草炭土∶珍珠巖∶蛭石=7∶2∶1，培養(yǎng)3周后母株開始形成大量匍匐莖，將匍匐莖固定于花盆周圍預(yù)鋪的珍珠巖基質(zhì)上，確保匍匐莖節(jié)能及時形成根系，繼續(xù)培養(yǎng)2～3周后，挑選節(jié)間長度適中、長勢良好、根系發(fā)育狀態(tài)一致的蛇莓相連分株，在連接狀態(tài)下將其栽至10 cm×10 cm的花盆中，用作試驗材料。溫室內(nèi)氣溫為26 ℃左右，相對濕度為70%～75%。

1.2 材料處理

選取長勢一致的成對蛇莓植株80對，相連分株與斷開分株各40對，并標(biāo)記好姊株(X)、妹株(Y)，斷開分株組為對照組。配制0(對照)、100、200、300mmol·L-14個濃度水平NaCl溶液進(jìn)行脅迫，每3 d對蛇莓姊株施加100 mL的NaCl溶液，施加前先用去離子水沖洗基質(zhì)，以減少前攝鹽分基質(zhì)對NaCl濃度的影響，相連妹株施加等量的水(圖1)。培養(yǎng)第14 天時，取樣測定有關(guān)指標(biāo)，每個處理10對，生物量與過氧化氫含量部位的測定每個處理3次重復(fù)，葉片相對含水量和細(xì)胞膜透性的測定每個處理重復(fù)8次。

圖1 處理示意圖Fig. 1 Porcessing diagram

1.3 整株生物量的測定

選取完整植株洗凈后，剪除匍匐莖，置于105 ℃烘箱中殺青20 min后，70 ℃下烘干48 h至恒重，稱其總生物量。

1.4 植物相對含水量的測定

取植物葉片用去離子水迅速沖洗干凈，用吸水紙擦干其表面水分后稱其鮮重(Wf)。將葉片完全浸泡于蒸餾水24 h至恒重，稱其飽和鮮重(Wt)。將新鮮材料置于105 ℃烘箱中殺青20 min后，70 ℃下烘干48 h至恒重，稱其干重(Wd)。

相對含水量RWC=(Wf-Wd)/(Wt-Wd)×100%。

1.5 植物細(xì)胞膜透性的測定

取植物葉片用去離子水迅速沖洗干凈，用吸水紙擦干其表面水分后，使用直徑為5 mm的打孔器避開葉脈打孔，置于10 mL去離子水中完全浸泡12 h，使用DDS-12DW電導(dǎo)率儀測得電導(dǎo)率EC1。再置于沸水浴加熱20 min，使質(zhì)膜完全被破壞，待冷卻至室溫后，測得電導(dǎo)率EC2。細(xì)胞膜透性=EC1/EC2×100%。

1.6 植物過氧化氫含量的測定

配制3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色液，使用NaOH將pH調(diào)至5.8，浸泡蛇莓葉片，于28 ℃下避光保存8 h，光照8 h進(jìn)行充分染色。倒凈并吸取染色液后加入80%乙醇溶液，沸水浴加熱至葉片完全脫色。靜置至室溫后取出葉片拍照記錄，將照片使用Image J處理，計算葉片染色部位與葉片總面積之比(圖2)。

1.7 統(tǒng)計分析

采用Valladares等[20]的方法計算各指標(biāo)的可塑性指數(shù)，即4個鹽濃度梯度下，某變量的最大值與最小值之差除以最大值。使用Microsoft Office Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理和作圖，SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，并用Duncan’s法檢驗其差異顯著性。

圖2 不同NaCl濃度處理對蛇莓匍匐莖相連與斷開狀態(tài)下的葉片過氧化氫氧化面積比例Fig. 2 Effect of different salt concentration on H2O2 proportion of the proximal ramets with connecting or severing stolon

2 結(jié)果與分析

2.1 在相連或斷開狀態(tài)下鹽脅迫對蛇莓姊株的影響

在300 mmol·L-1NaCl脅迫下，匍匐莖連接狀態(tài)下蛇莓姊株的生物量顯著高于匍匐莖斷開蛇莓姊株的(P<0.05)。其他濃度0、100、200 mmol·L-1NaCl處理的則相反，斷開姊株高于連接的姊株，但差異不顯著(P>0.05)(圖3)；與斷開姊株相比，100和200 mmol·L-1NaCl脅迫下，相連蛇莓葉片相對含水量分別上升了13.35%、18.30%，二者差異顯著(P<0.05)；第14天時，300 mmol·L-1的NaCl脅迫下的蛇莓單株出現(xiàn)死亡；100、200 mmol·L-1濃度NaCl脅迫下，蛇莓姊株在斷開狀態(tài)下葉片細(xì)胞膜透性顯著高于匍匐莖連接狀態(tài)下葉片細(xì)胞膜透性(P<0.05)，不同狀態(tài)下蛇莓?dāng)嚅_姊株葉片細(xì)胞膜透性隨NaCl濃度的升高而顯著增大(P<0.05)，100和200 mmol·L-1NaCl脅迫下斷開姊株葉片細(xì)胞膜透性較匍匐莖連接狀態(tài)分別上升了18.91%、59.83%；在100 mmol·L-1NaCl脅迫下的蛇莓姊株在不同狀態(tài)下H2O2含量的差異不顯著(P>0.05)；200 mmol·L-1濃度的NaCl處理下，蛇莓姊株在斷開姊株葉片H2O2含量明顯大于匍匐莖連接姊株葉片(P<0.05)。

比較4種鹽濃度處理蛇莓姊(X)株在匍匐莖連接或斷開狀態(tài)時生物量、相對含水量、細(xì)胞膜透性和過氧化氫含量的可塑性指數(shù)可看出，過氧化氫含量的可塑性指數(shù)最高(0.76)，生物量與細(xì)胞膜透性次之，分別為0.6和0.58，相對含水量最小(0.2)，整體來看蛇莓受到鹽脅迫時生理可塑性(細(xì)胞膜透性與過氧化氫含量)>生長可塑性(生物量和相對含水量)。在該4項指標(biāo)中，蛇莓姊株在匍匐莖斷開狀態(tài)下的可塑性指數(shù)均大于其在相連時的可塑性指數(shù)。

2.2 鹽脅迫對蛇莓相連姊妹株的影響

當(dāng)相連姊株受不同濃度NaCl處理時，其相連妹株間的生物量、相對含水量與細(xì)胞膜透性與對照間無顯著變化(P>0.05)；而隨著姊株受到NaCl處理濃度的升高，與其相連的妹株葉片的H2O2含量較對照也隨之大幅度升高，100、200和300 mmol·L-1NaCl脅迫下葉片的H2O2含量較對照顯著上升(P<0.05)，分別上升了46.16%、57.15%、56.25%(圖4)。

圖3 不同NaCl濃度處理對匍匐莖相連與斷開狀態(tài)下蛇莓姊(X)株生物量、相對含水量、細(xì)胞膜透性和H2O2含量的影響Fig. 3 Effect of different salt concentrations on total biomass, relative water content (RWC), membrane permeability, and H2O2 proportion of the proximal ramets (X) with connecting or severing stolon

不同小寫字母表示不同鹽濃度處理間的差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示相連與斷開狀態(tài)間差異顯著(P<0.05)。圖4同。

Different lowercase letters indicate significant difference among different NaCl concentration treatments at the 0.05 level and different capital letters indicate significant difference between connected and severed stolon at the 0.05 level; similarly for the Figure 4.

圖4 不同NaCl濃度處理成對蛇莓相連姊(X)妹(Y)株生物量、相對含水量、細(xì)胞膜透性和H2O2含量的影響Fig.4 Effect of different salt concentrations on total biomass, relative water content (RWC), membrane permeability, and H2O2 proportion of proximal ramets (X) and distal ramets (Y) with connecting stolons

100、200、300 mmol·L-1的NaCl脅迫下的蛇莓相連分株中，姊株與妹株之間的生物量出現(xiàn)了差異，姊株生物量顯著低于妹株生物量(P<0.05)，姊株比妹株的生物量分別下降了33.15%、51.12%、53.74%(圖4)。100、200、300 mmol·L-1的NaCl脅迫下，姊株與妹株之間的相對含水量、細(xì)胞膜透性、H2O2含量均出現(xiàn)了顯著差異(P<0.05)，在100、200和300 mmol·L-1NaCl脅迫下，姊株葉片的相對含水量比妹株的下降了7.34%、12.26%、17.97%；100、200、300 mmol·L-1的NaCl脅迫下，姊株葉片的細(xì)胞膜透性和過氧化氫含量比妹株顯著上升(P<0.05)，分別上升了36.96%、57.56%、103.44%和7.85%、35.36%、66.17%。

3 討論與結(jié)論

環(huán)境異質(zhì)性在自然環(huán)境中普遍存在，這使得植物獲取必需資源的難度大大增加[21]。相對于非克隆植物，生理整合特性增強(qiáng)了克隆植物對異質(zhì)性環(huán)境的適應(yīng)能力[22]，如克隆植物空心蓮子草(Alternantheraphiloxeroides)的克隆整合特性使其對酸雨脅迫有著較好的適應(yīng)性[23]。生物量是植物耐鹽性最直接的指標(biāo)，也是植物對鹽分脅迫的綜合表現(xiàn)[24-25]。異質(zhì)性鹽脅迫下，蛇莓?dāng)嚅_姊株生物量顯著下降，而在各濃度處理下的相連姊株生物量則未呈現(xiàn)明顯差異，說明在蛇莓相連分株中，未處理的相連妹株會通過生理整合作用對受到NaCl處理的姊株起到緩解作用，克隆植物沙鞭(Pasammochloavillosa)在風(fēng)蝕條件下也有著類似的表現(xiàn)[26]。而隨著鹽濃度的增加，蛇莓姊株受到NaCl脅迫加重時，相連妹株的生物量、葉片相對含水量與細(xì)胞膜透性并未隨之受到影響。這表明，妹株的生長并不因為姊株受到脅迫而受到明顯抑制。因此，在異質(zhì)性脅迫下未受脅迫或脅迫較輕的分株能夠保持較為正常的生長。

克隆植物的相連分株通過橫生結(jié)構(gòu)(間隔子)互相連接，為分株間的物質(zhì)傳輸和交換提供了可能[27]。蛇莓姊株相連狀態(tài)下葉片的相對含水量與斷開狀態(tài)下相比，隨著濃度的升高，差異顯著，證明了蛇莓相連分株中的克隆整合能夠緩解姊株受到的脅迫作用。Alpert等[28]、羅棟等[29]和Zhang等[30]在野牛草(Buchloedactyloides)、草莓(Fragariachiloensis)、空心蓮子草等克隆植物中發(fā)現(xiàn)，處于高養(yǎng)分的分株可給低養(yǎng)分的分株提供顯著的支持，實現(xiàn)資源共享。而當(dāng)受害程度積累后，受脅迫相連姊株的葉片細(xì)胞膜透性、過氧化氫含量與未受脅迫姊株比出現(xiàn)顯著差異，且濃度越高差異越顯著，說明這種緩解作用具有一定的限度。甚至，在入侵性克隆植物空心蓮子草具有較強(qiáng)的匍匐莖斷裂機(jī)制，當(dāng)受脅迫株受害嚴(yán)重時，近株端的匍匐莖干枯，具有主動“切斷”生理整合的可能[31]。有的克隆植物長期于逆境環(huán)境時，會減少或中斷克隆分株間的資源共享，從而利用更多的資源抵御脅迫環(huán)境[32]。生長于干旱沙漠的賴草(Leymussecalinus)在產(chǎn)生新分株時則較少依賴相鄰分株供給的資源，以利于減少資源運輸時的消耗[33]。

細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的主要通道，對維持細(xì)胞正常代謝起著重要作用[34]。在逆境條件下，脅迫因子積累到一定時間或強(qiáng)度時，細(xì)胞膜直接受到逆境的傷害，當(dāng)其受到損傷后，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)擴(kuò)散出細(xì)胞，通過測定細(xì)胞膜透性的變化，反映逆境脅迫對細(xì)胞膜的傷害程度[35]。本研究表明，蛇莓姊株在與妹株相連或斷開狀態(tài)下，受脅迫姊株的膜系統(tǒng)均受到一定程度的損傷，并隨著脅迫時間的延長、濃度的升高而加劇。姊株在匍匐莖斷開狀態(tài)下的細(xì)胞膜透性明顯高于其在連接狀態(tài)下的細(xì)胞膜透性，與此同時相連分株的妹株與空白對照相比，其細(xì)胞膜透性也呈現(xiàn)出差異。

研究過程發(fā)現(xiàn)，在300 mmol·L-1的NaCl溶液處理14 d時，受脅迫蛇莓姊株在單株狀態(tài)下時已死亡，而在與妹株相連時還依然存活，且各項指標(biāo)中前者的可塑性指數(shù)均高于后者，說明單株狀態(tài)的姊株受脅迫程度較重，連株狀態(tài)的未受脅迫妹株通過匍匐莖對相連姊株受到的脅迫起到緩解作用。與此同時，在匍匐莖相連狀態(tài)的處理組中，未受脅迫的妹株受到姊株的牽連并不顯著，繼而妹株進(jìn)行較為正常的生長。由此表明，在高濃度鹽脅迫下，克隆植物相連分株的適應(yīng)性明顯優(yōu)于非克隆植物或克隆植物單株，這與前人研究在異質(zhì)環(huán)境中克隆植物結(jié)縷草(Zoysiajaponica)克隆分株在連接或斷開下的影響[36]以及克隆植物白三葉(Trifoliumrepens)、蛇莓、活血丹(Glechomalongituba)對異質(zhì)性UV-B輻射的響應(yīng)有著相似的發(fā)現(xiàn)[37]。

鹽脅迫作為影響植物正常生長與生理代謝的主要逆境因子[38-39]，會誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧，發(fā)生氧化反應(yīng)，將生物大分子降解成各種小分子物質(zhì)并生成具強(qiáng)氧化性的過氧化物，導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化[40]。3，3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色技術(shù)是對植物內(nèi)源H2O2原位定位的染色方法，DAB可與H2O2在產(chǎn)生處反應(yīng)，形成褐色斑點，因此利用DAB染色可以對葉片進(jìn)行組織化學(xué)原位測定[41]，并通過圖片處理即可計算過氧化氫的聚集情況。本研究結(jié)果表明，在中、高濃度NaCl處理時，匍匐莖斷開時的姊株葉片積累的H2O2明顯高于相連分株姊株葉片；在各濃度脅迫中，未受處理的相連分株中的妹株與空白對照比也呈現(xiàn)明顯差異；姊、妹株的差異隨處理時間的延長而逐漸顯現(xiàn)。這表明，在蛇莓相連分株中，匍匐莖具有傳遞信號的功能，并通過生理整合的作用緩解受脅迫植株的傷害。然而具體的信號分子及其響應(yīng)機(jī)制尚不明朗，還需做進(jìn)一步探究。

鹽脅迫抑制了蛇莓植株的生長，使得細(xì)胞膜透性、過氧化氫氧化活性升高；克隆植物蛇莓分株在連接狀態(tài)下，一定程度上緩解了鹽脅迫對蛇莓姊株生長造成的氧化傷害，維持了膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性與完整性，從而增強(qiáng)了蛇莓姊株的耐鹽性。雖然本研究從蛇莓植株生長與生理角度揭示了克隆植物蛇莓分株在相連與斷開狀態(tài)下對鹽脅迫的響應(yīng)，但對異質(zhì)環(huán)境脅迫感知的信號分子及傳遞形式仍不明確。因此，結(jié)合形態(tài)反映、生理代謝調(diào)節(jié)，進(jìn)一步分離和鑒定逆境響應(yīng)相關(guān)信號分子并明確其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將有助于更全面解析蛇莓對異質(zhì)逆境的響應(yīng)及適應(yīng)性調(diào)控機(jī)制。