魏瑞成，羅盼盼，張圣新，朱 磊，鮑恩東，李兆君，王 冉*

（1.江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（南京），江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

獸藥抗生素為現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展和動(dòng)物源產(chǎn)品的豐富供給發(fā)揮了重要作用，據(jù)報(bào)道，2011—2012年美國抗生素的生產(chǎn)量為1.79萬t，在養(yǎng)殖業(yè)中使用占到其總量的84.56%，2013年英國抗生素的生產(chǎn)量為0.106萬t，用在養(yǎng)殖業(yè)中的份額占到其總量的37.92%，我國2013年用在養(yǎng)殖業(yè)中的抗生素約8.4萬t，占抗生素生產(chǎn)總量的51.85%[1]。研究發(fā)現(xiàn)，約有30%～90%的抗生素將以母體或代謝產(chǎn)物的形式隨畜禽糞尿排出體外[2-3]，四環(huán)素類、喹諾酮類等抗生素在畜禽糞便中的殘留濃度范圍每千克在幾十至上百毫克[4-6]，隨著糞肥的貯存和在農(nóng)田施用，殘留的藥物經(jīng)過吸附、遷移、滲透、淋溶等方式進(jìn)入土壤、地表水和地下水。由于抗生素對(duì)土壤或底泥有較好的吸附，造成土壤和水體環(huán)境中四環(huán)素類、磺胺類等抗生素殘留檢出量明顯高于其他類抗生素[7]，Hamscher等調(diào)查長期施肥時(shí)，發(fā)現(xiàn)土霉素在30 cm土層中檢出量高且長期存在[8]，因此，由抗生素引起的細(xì)菌耐藥性問題也日益嚴(yán)重[9]。預(yù)計(jì)到2020年我國養(yǎng)殖業(yè)排放的糞便等污染物較現(xiàn)在將大幅增加，糞污的資源化利用可能導(dǎo)致藥物殘留污染問題的加劇[10]，采取有效方式促進(jìn)動(dòng)物糞便中抗生素的降解將是阻控其向環(huán)境轉(zhuǎn)移的重要手段。

畜禽糞便處理的腐熟過程以及土壤環(huán)境中化學(xué)肥料的施用均伴隨著pH和離子濃度等因素變化[11-13]，將影響糞便中殘留抗生素的析出、降解和遷移，該過程與抗生素在畜禽糞便中的吸附作用密切相關(guān)。目前，研究抗生素在土壤、底泥等環(huán)境介質(zhì)中的吸附遷移行為報(bào)道較多，而對(duì)畜禽糞便中抗生素的吸附和遷移行為研究不足，對(duì)深入理解糞便及糞-土壤體系中抗生素的轉(zhuǎn)歸特征，研發(fā)適宜阻控方法缺乏理論和技術(shù)支撐。因此，本研究選擇養(yǎng)殖業(yè)常用的四環(huán)素類抗生素多西環(huán)素（Doxycycline，DOX）為研究對(duì)象，該藥物飼喂動(dòng)物后，約有85%以原形或代謝物的形式進(jìn)入環(huán)境[14]，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品安全和環(huán)境生態(tài)產(chǎn)生危害，通過批處理平衡試驗(yàn)，研究其在動(dòng)物糞便中的吸附規(guī)律，探討吸附與解吸附行為以及影響因素，為進(jìn)一步研究糞源抗生素的環(huán)境遷移風(fēng)險(xiǎn)及污染后的治理提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥97.0%）購自Dr.Ehren?storfer公司；甲醇和乙腈（色譜純）購自Tedia公司；甲酸（色譜純）購自ROE公司；鹽酸、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、乙二酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉、硝酸鈉、疊氮鈉、氯化鈉、氯化鉀和氯化鈣等試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent 1100S，配二極管陣列檢測器DAD）為Agilent公司產(chǎn)品；分析天平（AL204）、pH計(jì)（320）為梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；漩渦混合器（XW-80A）為上海琪特分析儀器有限公司產(chǎn)品；調(diào)速多用振蕩器（HY-4）為常州國華電器有限公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)（Eppendorf）為德國Eppendorf公司產(chǎn)品；超純水儀（Milli-Q）為美國Milli?pore公司產(chǎn)品；氮吹儀（N-EVAPTM112）為美國 Or?ganomation公司產(chǎn)品；固相萃取裝置為美國Supelco公司產(chǎn)品；HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL）為美國Wa?ters公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集與預(yù)處理

采集健康A(chǔ)A肉雞糞，避光風(fēng)干，研磨過2 mm篩用于后續(xù)試驗(yàn)，供試雞糞無藥物殘留。對(duì)照組雞糞在試驗(yàn)前滅菌3次，用于考察微生物在試驗(yàn)過程中對(duì)多西環(huán)素降解的影響。供試雞糞基本性狀見表1。

1.2.2 吸附平衡時(shí)間試驗(yàn)

吸附試驗(yàn)參照OECD Guideline106批平衡方法，稱取若干份上述樣品1 g，置于50 mL離心管中，分別加入10 mL濃度為63.3 mg·L-1的多西環(huán)素水溶液（0.01 mol·L-1NaNO3，0.02%NaN3，pH 5.5）。在 25±1 ℃ 200 r·min-1恒溫?fù)u床中避光振蕩，分別于5、10、20、30、40、50、60、90、120、240、360、480、720、1440、2880 min時(shí)將離心管取出，11 000 r·min-1離心10 min，取上清液測定多西環(huán)素濃度，繪制吸附曲線。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置5個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置無雞糞的多西環(huán)素對(duì)照組和滅菌雞糞對(duì)照組，用于考察吸附過程中多西環(huán)素自身降解以及微生物影響損失情況。

表1 供試雞糞基本性狀Table 1 Basic properties of poultry manuere used

1.2.3 多西環(huán)素在雞糞中吸附-解吸附行為研究

稱樣方法同1.2.2，分別加入25 mL濃度為59.04、77.57、101.18、118.61 mg·L-1和134.45 mg·L-1的多西環(huán)素水溶液（0.01 mol·L-1NaNO3，0.02%NaN3，pH 5.5），每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)，以200 r·min-1在25±1℃恒溫?fù)u床中避光振蕩24 h后，11 000 r·min-1離心10 min，取上清液測定多西環(huán)素濃度。

將上述試驗(yàn)的離心管離心去上清液、倒置瀝干，然后分別加入25 mL解吸附溶液（0.01 mol·L-1NaNO3，0.02%NaN3，pH 5.5），操作同上。根據(jù)起始濃度與平衡濃度之差計(jì)算其在雞糞中吸附量，繪制吸附-解吸附平衡曲線。

1.2.4 pH值對(duì)雞糞中多西環(huán)素解吸附的影響

稱樣方法同1.2.2，分別加入25 mL濃度為24.14 mg·L-1的多西環(huán)素水溶液（0.01 mol·L-1NaNO3，0.02%NaN3，pH 5.5），恒溫?fù)u床中避光振蕩24 h后離心去上清液、倒置瀝干。然后分別加入25 mL解吸附溶液（0.01 mol·L-1NaNO3，0.02%NaN3，pH 5.5），并將pH值分別調(diào)節(jié)到2、4、6、8、10，每個(gè)pH設(shè)置5個(gè)重復(fù)。在恒溫?fù)u床中避光振蕩24 h后，11 000 r·min-1離心10 min，取上清液測定多西環(huán)素濃度，研究不同pH值對(duì)雞糞中多西環(huán)素解吸附的影響。

1.2.5 不同離子類型及強(qiáng)度對(duì)雞糞中多西環(huán)素解吸附的影響。

處理同1.2.4，向倒置瀝干的離心管中分別加入25 mL 0.01 mol·L-1CaCl2、0.01 mol·L-1NaCl、0.01 mol·L-1NaNO3和 0.01 mol·L-1KCl溶液（0.02%NaN3，pH 5.5），研究不同陽離子類型對(duì)雞糞中多西環(huán)素解吸附的影響。向倒置瀝干的離心管中分別加入25 mL 0.1 mol·L-1CaCl2、0.01 mol·L-1CaCl2、0.1 mol·L-1NaCl、0.01 mol·L-1NaCl、0.1 mol·L-1NaNO3、0.01 mol· L-1NaNO3、0.1 mol·L-1KCl和 0.01 mol·L-1KCl溶液（0.02%NaN3，pH 5.5），研究不同離子強(qiáng)度對(duì)雞糞中多西環(huán)素解吸附的影響。

1.3 樣品中多西環(huán)素分析方法

固相萃取柱分別用甲醇和0.1 mol·L-1Na2EDTAMcllvaine緩沖溶液（pH=4.0）各6 mL進(jìn)行活化，將離心后的上清液裝載過柱，控制流速3 mL·min-1，然后用10 mL水淋洗并抽干，甲醇8 mL洗脫，洗脫液在40℃水浴中氮?dú)獯到?，加?.0 mL流動(dòng)相溶解殘余物，過0.22 μm針式濾器后供高效液相色譜測定。為了減少基質(zhì)干擾，溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線用0.01 mol·L-1NaNO3（0.02%NaN3，pH 5.5）溶解液配制。取空白雞糞的提取液，分別加入適量強(qiáng)力霉素，配成濃度為10、20 μg·100 mL-1和50 μg·100 mL-1加標(biāo)水樣，添加回收結(jié)果表明，多西環(huán)素在加標(biāo)樣品中平均回收率91.55%～95.14%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.66%～6.45%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%～0.75%，檢測限為0.1 mg·L-1。方法滿足試驗(yàn)研究需要。

色譜操作條件為：分析柱SB-C185 μm（4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為0.01 mol·L-1乙二酸溶液∶（甲醇/乙腈）（甲醇和乙腈為1∶1）比例為65∶35，流速為1.0 mL·min-1，波長為350 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 16軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析，用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞糞中多西環(huán)素的吸附過程

雞糞對(duì)多西環(huán)素的吸附量隨時(shí)間變化情況見圖1。圖中表明，多西環(huán)素在雞糞中被快速吸附，在0～4 h內(nèi)，雞糞對(duì)其的吸附率達(dá)到83%；在4～24 h內(nèi)，溶液中多西環(huán)素濃度下降緩慢；在24～48 h內(nèi)，濃度保持持平，說明雞糞對(duì)多西環(huán)素的吸附在24 h時(shí)達(dá)到吸附平衡狀態(tài)，此時(shí)吸附率約為90%。試驗(yàn)過程中分別比較了無雞糞對(duì)照組和標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及滅菌雞糞對(duì)照組與未滅菌試驗(yàn)組間多西環(huán)素含量變化情況，未見明顯差異，說明試驗(yàn)過程中多西環(huán)素降解可以忽略不計(jì)。

2.2 雞糞中多西環(huán)素吸附-解吸附特征

多西環(huán)素在雞糞中的吸附特征表現(xiàn)為非線性吸附，用Freundlich方程對(duì)吸附等溫線進(jìn)行擬合，結(jié)果見圖2。

式中：Cs為雞糞中多西環(huán)素的吸附量，mg·kg-1；Ce為吸附平衡后溶液中多西環(huán)素濃度，mg·L-1；kads表示吸附容量，但不代表最大吸附量，其值越大，則多西環(huán)素吸附速率越快；1/nads是與溫度有關(guān)的吸附常數(shù)。由k值和n值可看出，雞糞對(duì)多西環(huán)素有著較強(qiáng)的吸附力。在解吸附等溫線擬合方程中，kdes表示解吸附容量，1/ndes是與溫度有關(guān)的解吸附常數(shù)。擬合結(jié)果見表2。

圖2 雞糞中多西環(huán)素吸附等溫曲線Figure 2 Adsorption isotherm curve of DOX in chicken manure

表2 雞糞中多西環(huán)素吸附和解吸附等溫線參數(shù)Table 2 Adsorption and desorption isotherms of DOX in chicken manure

對(duì)于非線性吸附，為了明確目標(biāo)物的解吸附行為特征，引入吸附和解吸附等溫線的遲滯系數(shù)H：

式中：1/nads和1/ndes分別是吸附和解吸附等溫線Freun?dlich方程的斜率。

由表2可知，1/nads值小于1/ndes，表明多西環(huán)素在雞糞中為可逆性吸附，在合適的解吸附溶液作用下，雞糞吸附的多西環(huán)素將能夠析出，堆肥或者施肥情況下，雨水等淋洗作用將引起雞糞中多西環(huán)素遷移，對(duì)水體和土壤產(chǎn)生污染風(fēng)險(xiǎn)。遲滯系數(shù)接近1，表明解吸附過程基本不受遲滯效應(yīng)影響，但lg kads和lg kdes值分別為2.663 8和3.072 1，則預(yù)示雞糞對(duì)多西環(huán)素具有較高的吸附容量，能被解吸附的藥物濃度與雞糞對(duì)其的吸附量不成正比，這與試驗(yàn)結(jié)果相一致。

2.3 pH對(duì)雞糞中多西環(huán)素解吸附的影響

pH對(duì)雞糞中多西環(huán)素解吸附的影響見圖3。結(jié)果表明，pH值為2時(shí)，對(duì)雞糞中多西環(huán)素的解吸附率達(dá)到7.5%，pH值為4時(shí)，解吸率為6.0%，前者與pH值為4時(shí)解吸附量相比，存在顯著差異（P＜0.05），與pH值為6、8、10時(shí)相比存在極顯著差異（P＜0.01）。pH值在6～10時(shí)，解吸率在4.6%～4.9%范圍，隨著pH值的變化，解吸附能力沒有明顯改變。

圖3 pH對(duì)糞便中多西環(huán)素解吸附的影響Figure 3 Effect of pH on the desorption of doxycycline in feces

2.4 不同離子對(duì)雞糞中多西環(huán)素解吸附的影響

2.4.1 離子類型對(duì)雞糞中多西環(huán)素解吸附的影響

不同離子對(duì)雞糞中多西環(huán)素解吸附的影響見圖4。結(jié)果表明，在 0.01 mol·L-1離子濃度下，Na+、K+和Ca2+離子對(duì)雞糞中多西環(huán)素的解吸附能力存在差異，Ca2+溶液的解吸附能力高于其他兩種陽離子，Na+和K+的解吸附能力基本一致，但三者間差異不顯著，可能是加入的陽離子與多西環(huán)素共同競爭雞糞中吸附位點(diǎn)，由于離子強(qiáng)度較低，造成多西環(huán)素在雞糞中解吸附量差異不明顯。

2.4.2 離子強(qiáng)度對(duì)雞糞中多西環(huán)素解吸附的影響

圖4 不同陽離子對(duì)糞便中多西環(huán)素解吸附的影響Figure 4 Effect of different cations on the desorption of doxycycline in feces

不同離子強(qiáng)度對(duì)雞糞中多西環(huán)素解吸附的影響見圖5。結(jié)果表明，多西環(huán)素在雞糞中吸附量與解吸附溶液離子強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)，在0.1 mol·L-1離子濃度作用下，雞糞中多西環(huán)素吸附量下降。在0.01 mol·L-1NaNO3與 0.1 mol·L-1NaNO3、0.01 mol·L-1CaCl2與 0.1 mol·L-1CaCl2處理組間解吸附能力差異極顯著（P＜0.01），0.1 mol·L-1CaCl2處理組與其他處理組間差異也極顯著（P＜0.01），而0.01 mol·L-1KCl與0.1 mol·L-1KCl、0.01 mol·L-1NaCl與 0.1 mol·L-1NaCl對(duì)雞糞中多西環(huán)素的解吸附影響不明顯（P＞0.05），說明不同離子類型和離子強(qiáng)度對(duì)雞糞中多西環(huán)素的解吸附作用存在差異，0.1 mol·L-1和Ca2+對(duì)糞污中抗生素的析出和遷移均有促進(jìn)作用。

3 討論

圖5 不同離子強(qiáng)度對(duì)糞便中多西環(huán)素解吸附的影響Figure 5 Effect of different ionic strength on desmoxin dismantling of feces

畜禽糞肥施用是環(huán)境中獸藥殘留污染的重要來源，研究典型獸藥抗生素與畜禽糞便的吸附與解吸附作用，是揭示其在動(dòng)物排泄物中遷移行為的重要前提，對(duì)了解抗生素對(duì)環(huán)境污染和作用機(jī)理及阻控抗生素由糞便向環(huán)境遷移具有十分重要的作用。本試驗(yàn)以養(yǎng)殖業(yè)常用四環(huán)素類抗生素多西環(huán)素為研究對(duì)象，研究了雞糞對(duì)其吸附特征，結(jié)果表明，雞糞對(duì)多西環(huán)素的吸附在試驗(yàn)初始階段達(dá)80%以上，24 h內(nèi)達(dá)到吸附平衡，吸附過程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)曲線，該過程可能與溶質(zhì)分子快速擴(kuò)散相關(guān)。快速擴(kuò)散過程中溶質(zhì)分子附著在雞糞表面，向擴(kuò)散阻力最小的徑向方向運(yùn)動(dòng)，在受到狹窄孔徑的阻力后，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁傥絒15]，隨著多西環(huán)素分子逐漸占據(jù)雞糞顆粒表面，表面吸附力減弱直至吸附和解吸附趨于平衡，本結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的土霉素和金霉素在土壤中的吸附行為及磺胺類在豬糞中的吸附行為相一致[16-17]。

多西環(huán)素在雞糞中的吸附/解吸附曲線呈非線性，根據(jù)吸附強(qiáng)度（1/n）與吸附等溫線形狀的關(guān)系[18]，糞便中多西環(huán)素的吸附強(qiáng)度值低于1，其等溫吸附線為“L型”，表明在一定條件下，雞糞中多西環(huán)素吸附比例將隨著藥物濃度的增加而減少。有機(jī)污染物在環(huán)境介質(zhì)上的吸附包括物理、靜電、化學(xué)和孔隙填充吸附，介質(zhì)中無機(jī)物和無定型碳與線性吸附有關(guān)，有機(jī)質(zhì)則會(huì)導(dǎo)致吸附等溫線偏離線性，偏離程度與有機(jī)質(zhì)含量和比表面正相關(guān)[19]，Mackay等[20]研究了土壤中有機(jī)質(zhì)含量對(duì)土霉素吸附的影響，發(fā)現(xiàn)有機(jī)質(zhì)含量＞9%時(shí)將對(duì)吸附產(chǎn)生顯著影響。由于土壤中有機(jī)質(zhì)含量偏低，四環(huán)素類抗生素在土壤中的吸附等溫線接近線性，本研究中等溫線呈非線性，兩類介質(zhì)中有機(jī)質(zhì)含量顯著差異是導(dǎo)致結(jié)果不一致的主要原因[20-21]。雞糞中多西環(huán)素的可逆性吸附和解吸附時(shí)較低的遲滯效應(yīng)均表明其在一定條件下將向貯存或施用環(huán)境遷移，對(duì)水體和土壤環(huán)境存在遷移污染風(fēng)險(xiǎn)，較高的吸附容量又導(dǎo)致轉(zhuǎn)移時(shí)間的持久性，長期暴露在低水平抗生素濃度下將破壞環(huán)境中微生物多樣性并誘導(dǎo)抗性基因的產(chǎn)生和傳播[22]。

多西環(huán)素在畜禽糞便中的吸附存在離子交換機(jī)制與其兩性分子性質(zhì)相關(guān)，在水溶液中多西環(huán)素解離常數(shù)分別為pKa1 3～4、pKa2 7～8和pKa3 9～10，pH值和離子對(duì)其吸附行為具有重要影響。研究表明，在不同pH值溶液中多西環(huán)素的離子形態(tài)發(fā)生變化，溶液pH值為2和4時(shí)，多西環(huán)素在溶液中主要呈陽離子形態(tài)，此時(shí)雞糞表面的負(fù)電荷數(shù)量較少，兩者通過靜電進(jìn)行吸附，表現(xiàn)出較強(qiáng)的解吸附能力；溶液pH值在4～10時(shí)，多西環(huán)素主要以兩性離子形態(tài)存在，但隨著pH值升高，雞糞表面聚集負(fù)電荷增多，多西環(huán)素在雞糞中吸附量增加[23]，解吸附能力下降。文獻(xiàn)報(bào)道土霉素在土壤中的吸附量與pH值呈負(fù)相關(guān)，本研究結(jié)果也表現(xiàn)出相似的趨勢[24]，因此，調(diào)整和完善糞便處理過程中的腐熟工藝，在保持適宜pH范圍內(nèi)，有利于糞便中殘留的抗生素以游離狀態(tài)析出，促進(jìn)抗生素的降解。試驗(yàn)中離子強(qiáng)度增加，促進(jìn)了雞糞中多西環(huán)素解吸附，在解吸附能力上二價(jià)陽離子對(duì)其作用效果明顯強(qiáng)于一價(jià)離子，這與兩者共同競爭雞糞表面負(fù)電荷吸附位點(diǎn)有關(guān)[25]，此結(jié)果與Figueroa等[24]報(bào)道不同濃度Na+體系影響土霉素吸附結(jié)果相一致，表明糞便處理前應(yīng)加強(qiáng)共腐熟物質(zhì)的篩選，腐熟過程中易產(chǎn)生離子的物質(zhì)將有利于抗生素的解吸附，同時(shí)在生產(chǎn)過程中施用離子型肥料將促進(jìn)糞便中殘留的抗生素向土壤環(huán)境的遷移。

4 結(jié)論

（1）本試驗(yàn)條件下，雞糞與多西環(huán)素具有較強(qiáng)的吸附力，以快速吸附為主，吸附和解吸附等溫線呈非線性，可以用Freundlich模型進(jìn)行擬合，雞糞對(duì)多西環(huán)素吸附容量較高，在外界因素作用下將對(duì)環(huán)境產(chǎn)生長期轉(zhuǎn)移污染。

（2）雞糞中多西環(huán)素的解吸附存在離子交換機(jī)制，pH和不同類型離子及離子強(qiáng)度影響其在雞糞中吸附量，一定的酸性環(huán)境、二價(jià)陽離子和較高的離子強(qiáng)度有利于抗生素的析出。

（3）雞糞中多西環(huán)素的吸附-解吸附特性表明，在酸雨、施用化學(xué)肥料等因素作用下，糞肥中多西環(huán)素析出能力增強(qiáng)，增加了向環(huán)境遷移的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在處理養(yǎng)殖場糞污時(shí)，調(diào)整處理過程的酸性環(huán)境和保持一定強(qiáng)度的離子將促進(jìn)殘留抗生素的析出和降解，本文為進(jìn)一步研究抗生素的環(huán)境遷移風(fēng)險(xiǎn)，及污染后的治理提供參考和借鑒。