梁爽， 龍文聰， 梁梓， 羅朝兵， 劉安萱， 廖鴻， 楊瑤君

(樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點實驗室，四川樂山614004)

長足大竹象Cyrtotrachelusbuqueti是竹林毀滅性害蟲，自2003年一直被列為我國林業(yè)危險性有害生物之一。據(jù)調(diào)查，四川省樂山市叢生竹林面積667 km2，長足大竹象平均蟲口密度為0.49頭/筍(楊瑤君等，2011)，而貴州省赤水市叢生竹林面積820 km2，平均蟲口密度低于0.01頭/筍。兩地相距不足300 km，蟲口密度卻相差48倍。生殖是維持昆蟲種群密度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的變化可能導(dǎo)致昆蟲繁殖能力或種群數(shù)量的顯著變化。2014—2017年，本課題組在田間調(diào)查時觀察到赤水地區(qū)長足大竹象雌蟲產(chǎn)卵數(shù)量較少，其生殖器官的結(jié)構(gòu)是否發(fā)生了顯著變化？其變化特點如何？

近年對長足大竹象的研究主要集中在頭部感器的超微結(jié)構(gòu)(楊瑤君等，2010)、成蟲體表信息化學(xué)物質(zhì)的提取和鑒定(忙定澤，2012)、營養(yǎng)成分(蒲遠(yuǎn)鳳等，2015)、繁殖性能(楊樺等，2015)與生物學(xué)特性及防治(聶學(xué)文，2010)等方面。在長足大竹象生殖系統(tǒng)方面，汪淑芳等(2009)對生殖結(jié)構(gòu)形態(tài)解剖及梁梓等(2016)對生殖系統(tǒng)中雄性附腺的抑菌作用進(jìn)行了研究。本文應(yīng)用解剖及掃描電鏡技術(shù)觀察樂山高種群密度、赤水低種群密度長足大竹象生殖系統(tǒng)的形態(tài)特征和超微結(jié)構(gòu)，比較二者的差異，以期分析赤水地區(qū)長足大竹象種群密度低的原因，為研究長足大竹象的種群特征和發(fā)生規(guī)律提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及試驗材料

貴州省赤水市大同鎮(zhèn)位于市境西面，與四川省敘永縣、合江縣毗鄰，低中山地、丘陵地形，屬中亞熱帶溫暖濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，年均溫度18.2 ℃，年均降水量1 280 mm，海拔228～1 280 m，主要竹種有毛竹Phyllostachyspubescens、慈竹Neosinocalamusaffinis、撐綠竹Bambusapervariabilis×Dendrocalamusdaii、麻竹Dendrocalamuslatiflorus、孝順竹Bambusamultiplex等(王潤秋，2014)。四川省樂山市沐川縣大楠鎮(zhèn)屬淺丘區(qū)兼有低山，年平均溫度17 ℃，年均降水量1 333.9 mm，海拔336～818 m，主要竹種有慈竹、撐綠竹、綿竹Lingnaniaintermedia、苦竹Pleioblastusamarus等(陳其勇等，2014)。2016年7—8月長足大竹象出土盛期，分別在四川省樂山市沐川縣大楠鎮(zhèn)(104°0′6.93″E，28°58′5.06″N，海拔532 m)和貴州省赤水市大同鎮(zhèn)(105°40′40.12″E，28°30′28.33″N，海拔358 m)慈竹林中采集雌雄成蟲各15只，用取自兩地的新鮮慈竹筍分開成對喂養(yǎng)，交配后收集受精卵。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度25 ℃、相對濕度75%、光周期12L∶12D，每2 d更換1次竹筍。

1.2 主要儀器及試劑

離子濺射儀Cressington108(Cressington，英國)、掃描電鏡Inspect F50(FEI，美國)、Leica EZ4 HD體視鏡(Leica，德國)等。所用試劑均為分析純，購自成都科龍化工試劑廠。

1.3 解剖及掃描電鏡觀察

長足大竹象內(nèi)、外生殖器的解剖方法參照汪淑芳等(2009)，雌雄成蟲各取15只進(jìn)行解剖、掃描電鏡觀察。解剖后的內(nèi)、外生殖器用足量生理鹽水清洗3次后，放入4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉/氫氧化鈉固定液中固定。參照楊瑞等(2014)的方法，將擬電鏡觀察的卵粒、雄性睪丸、雌雄性外生殖器等用固定液固定24 h以上，經(jīng)30%、50%、70%、90%、100%乙醇進(jìn)行逐級脫水，乙酸異戊酯置換處理10 min，經(jīng)臨界點干燥儀干燥，將干燥好的樣品觀察面向上粘臺，用Cressington108 離子濺射儀真空噴金。將經(jīng)上述處理過的樣品置于Inspect F50掃描電鏡下，觀察其生殖結(jié)構(gòu)形態(tài)特征并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SPSS 16.0、Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，運用t檢驗進(jìn)行差異顯著性分析。利用ImageJ對卵細(xì)胞和精細(xì)胞直徑、密度及外生殖器的長度等進(jìn)行測量，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生殖系統(tǒng)形態(tài)對比

樂山、赤水兩地長足大竹象雌性成蟲生殖結(jié)構(gòu)均由1對卵巢、1對側(cè)輸卵管、中輸卵管、交配囊、受精囊及產(chǎn)卵器組成，卵巢左右并列，呈乳白色，每個卵巢由2只卵巢管組成，卵巢管長約2.8 cm，每只卵巢管下端卵粒大而飽滿，向上逐級減小，5～6粒卵，每側(cè)卵巢管端絲匯成懸?guī)В恍坌猿上x生殖結(jié)構(gòu)均由1對睪丸、輸精管、射精管、附腺及外生殖器組成，每側(cè)睪丸由2只扁球狀睪丸管組成(圖1)。兩地雌雄成蟲生殖系統(tǒng)在形態(tài)結(jié)構(gòu)上未觀察到顯著差異。

2.2 內(nèi)生殖器超微結(jié)構(gòu)

2.2.1雌蟲卵黃顆粒對雌性長足大竹象受精卵內(nèi)部進(jìn)行電鏡掃描，可見大量呈橢圓形或圓形的卵黃蛋白充塞在原生質(zhì)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)。電鏡放大300倍，觀察到樂山地區(qū)卵黃顆粒(圖2：A)較赤水地區(qū)(圖2：D)密實，放大至3 000倍、10 000倍后，發(fā)現(xiàn)樂山雌蟲卵黃顆粒飽滿且表面光滑(圖2：B、C)，而赤水雌蟲卵黃顆粒表面粗糙、有鏤空(圖2：E、F)。測定卵黃顆粒密度、直徑，每萬立方微米內(nèi)卵黃顆粒的平均密度為：樂山地區(qū)10.4個、赤水地區(qū)11.9個；卵黃顆粒平均直徑為：樂山地區(qū)20.76 μm±1.33 μm、赤水地區(qū)15.26 μm±1.99 μm，二者差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 145)。

2.2.2雄蟲睪丸樂山、赤水兩地雄蟲睪丸內(nèi)部有明顯差異，樂山地區(qū)睪丸內(nèi)壁較為光滑(圖3：A、B、C)，赤水地區(qū)睪丸內(nèi)壁上有許多褶皺(圖3：D、E、F)，兩者內(nèi)部均可觀察到精細(xì)胞。每萬立方微米內(nèi)精細(xì)胞的數(shù)量為：樂山地區(qū)約400個、赤水地區(qū)約1 500個，相差近3倍；精細(xì)胞直徑為：樂山地區(qū)5.60 μm±0.51 μm、赤水地區(qū)3.31 μm±0.27 μm，二者差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 004)。

2.3 外生殖器超微結(jié)構(gòu)

2.3.1雌蟲外生殖器掃描電鏡結(jié)構(gòu)樂山、赤水兩地的產(chǎn)卵器鞘上均有成叢的剛毛，由產(chǎn)卵器鞘末端向上逐漸變短(圖4：A、D)，剛毛上著生刺狀凸起，剛毛區(qū)基部均勻著生芽狀小刺(圖4：B、E)，外生殖器中部有一片絨毛區(qū)(圖4：C、F)。分別測量其外生殖器長刺和小刺的長度、密度、絨毛區(qū)寬度等，兩地差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 樂山(A、B)、赤水(C、D)地區(qū)長足大竹象生殖系統(tǒng)Fig. 1 Reproductive system of Cyrtotrachelus buqueti from Leshan (A， B) and Chishui (C， D)

A， C. 雌蟲female， B， D. 雄蟲male； ovp. 產(chǎn)卵器ovipositor， C. 中輸卵管common oviduct， L. 側(cè)輸卵管lateral oviduct， ov. 卵巢ovary， bc. 交配囊bursa copulatrix， S. 受精囊spermatheca， li. 懸?guī)igament， pe. 陽莖penis， mu. 肌纖維鞘muscle fiber sheath， va. 輸精管vasa deferentia， sp. 睪丸管spermatic tube， te. 睪丸testis， ac. 附腺accessory gland

圖2 樂山(A～C)、赤水(D～F)地區(qū)長足大竹象雌性成蟲卵黃顆粒電鏡掃描Fig. 2 The egg of female Cyrtotrachelus buqueti from Leshan (A-C) and Chishui (D-F) as determined by using scanning electron microscopy

A， D. 300×， B， E. 3 000×， C， F. 10 000×

圖3 樂山(A～C)、赤水(D～F)地區(qū)長足大竹象雄性成蟲睪丸電鏡掃描Fig. 3 The testis of male Cyrtotrachelus buqueti from Leshan (A-C) and Chishui (D-F) as determined by using scanning electron microscopy

A， D. 5 000×， B， C， E， F. 10 000×

圖4 樂山(A～C)、赤水(D～F)地區(qū)長足大竹象雌性成蟲產(chǎn)卵器鞘電鏡掃描Fig. 4 External reproductive organs of female Cyrtotrachelus buqueti from Leshan (A-C) and Chishui (D-F) as determined by using scanning electron microscopy

A， D. 200×， B， E. 2 000×， C， F. 5 000×

2.3.2雄蟲外生殖器超微結(jié)構(gòu)樂山、赤水兩地雄蟲外生殖器末端的陽莖均為黑褐色骨化管狀結(jié)構(gòu)，向腹面彎曲，背面上半部骨化，下端為膜質(zhì)區(qū)帶(圖5：A、E)，表面局部著生成叢的纖毛(圖5：B、F)。橫切面掃描電鏡觀察到陽莖為雙層結(jié)構(gòu)，內(nèi)層萎縮形成層間中空(圖5：C、G)，內(nèi)層不規(guī)則卷迭，呈空腔結(jié)構(gòu)，內(nèi)陽莖壁不光滑，具有突起狀結(jié)構(gòu)(圖5：D、H)。分別測量陽莖壁厚度、內(nèi)陽莖壁凸數(shù)目等，兩地差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

形態(tài)解剖表明，樂山、赤水兩地不同種群密度的長足大竹象雌性成蟲生殖系統(tǒng)形態(tài)結(jié)構(gòu)未觀察到顯著差異，掃描電鏡觀察兩地成蟲外生殖器超微結(jié)構(gòu)也未觀察到顯著差異，但兩地成蟲卵黃顆粒、精細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。超微結(jié)構(gòu)研究表明，赤水地區(qū)低密度種群雌蟲卵黃顆粒表面粗糙有鏤空，直徑顯著小于樂山地區(qū)高密度種群，赤水地區(qū)雄蟲睪丸內(nèi)壁粗糙有褶皺，精細(xì)胞直徑極顯著小于樂山地區(qū)，每萬立方微米內(nèi)精細(xì)胞的數(shù)量超過樂山地區(qū)的2倍。由此可知，與樂山地區(qū)相比，赤水地區(qū)成蟲生殖系統(tǒng)卵黃顆粒、睪丸的結(jié)構(gòu)和大小及精細(xì)胞的數(shù)量均發(fā)生了顯著變化，這可能導(dǎo)致赤水地區(qū)種群的繁殖力下降，種群數(shù)量低。

環(huán)境因素、遺傳變異或遺傳變異與環(huán)境互作均可引起長足大竹象生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)發(fā)生變異。赤水地區(qū)大面積竹林為長足大竹象的種群繁育提供了充足的食物來源。若是遺傳變異導(dǎo)致種群數(shù)量大幅度降低，那么幸存?zhèn)€體在環(huán)境適宜、食源豐富的條件下應(yīng)能大量繁殖，且長足大竹象是遷飛性昆蟲，通過遷飛，亦可使其種群數(shù)量增加(?stmanetal.，2001；Eckertetal.，2008；Spearetal.，2010；He & Hubbell，2011)。由此推測，由環(huán)境因素引起赤水地區(qū)成蟲睪丸、卵黃顆粒結(jié)構(gòu)及精細(xì)胞大小產(chǎn)生變異的可能性較大。溫度是影響昆蟲生長發(fā)育和繁殖的重要因素之一，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)低溫會延緩雌性苜蓿葉象甲Hyperapostica(張娜等，2010)和甜菜夜蛾Spodopteraexigua(韓蘭芝等，2003)的性腺發(fā)育及卵子成熟；高溫影響雄性棉鈴蟲Helicoverpaarmigera精細(xì)胞囊、睪丸和附腺的發(fā)育，導(dǎo)致畸形精子束產(chǎn)生(郭慧芳等，2002)。緯度偏南的廣西南寧，年均溫度高于赤水，但慈竹林生長環(huán)境相似，長足大竹象種群數(shù)量仍高于赤水地區(qū)(梁祖昂，2017)。本研究發(fā)現(xiàn)，年均溫度相近的樂山和赤水兩地的長足大竹象成蟲在卵黃顆粒、睪丸的結(jié)構(gòu)和大小及精細(xì)胞的數(shù)量等方面卻有顯著差異。由此推測，溫度等氣候因子導(dǎo)致兩地長足大竹象成蟲生殖結(jié)構(gòu)變化的可能性不大。課題組實驗檢測還發(fā)現(xiàn)，赤水地區(qū)長足大竹象蛹室土壤中重金屬Hg的含量相對較高，為樂山地區(qū)的1.5倍以上(資料未發(fā)表)。大量研究表明，Hg影響酶活性，對生命活動、昆蟲種群可能造成毒害(沈維干，陳彥，2000；董杰影等，2004；樓哲豐等，2007)。長足大竹象的老熟幼蟲在地下蛹室化蛹羽化的時間長達(dá)11個月，蛹室土壤Hg含量顯著增加很可能會影響成蟲生殖器官的分化，進(jìn)而導(dǎo)致生殖細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，降低赤水地區(qū)種群的繁殖能力和種群數(shù)量。因此，土壤重金屬Hg含量的差異可能是導(dǎo)致兩地長足大竹象生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著差異的重要原因，但還需進(jìn)一步驗證。

圖5 樂山(A～D)、赤水(E～H)地區(qū)長足大竹象雄性成蟲外生殖器電鏡掃描
Fig. 5 External reproductive organs of maleCyrtotrachelusbuquetifrom Leshan (A-D) and Chishui (E-H) as determined by using scanning electron microscopy

A.陽莖基phallobase 43×， B. 陽莖基phallobase 150×， C. 陽莖橫切面penis transection 150×， D. 陽莖橫切面penis transection 1 000×，

E. 陽莖基phallobase 50×， F. 陽莖基phallobase 200×， G. 陽莖橫切面penis transection 200×， H.陽莖橫切面penis transection 1 000×

本研究首次比較了高、低種群密度地區(qū)地下生活史較長昆蟲長足大竹象生殖系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)的變化特點，研究結(jié)果對研究長足大竹象種群變化、種群發(fā)生等具有現(xiàn)實參考價值。