劉秋成， 翟曉飛， 王同亮， 汪繼超

(海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，?？?71158)

泛樹蛙屬Polypedates隸屬樹蛙科Rhacophoridae，目前該屬共24個物種(Frost，2017)。國外對泛樹蛙屬物種的研究發(fā)現(xiàn)，該屬物種的分類及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系較為復(fù)雜，同時也存在諸多爭議(Brownetal.，2010；Sheridanetal.，2010；Riyantoetal.，2011；Kuraishietal.，2012)。在國內(nèi)，Pan等(2013)在前人研究(Lietal.，2008，2009；Brownetal.，2010；Kuraishietal.，2012)的基礎(chǔ)上，基于分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重新評估了P.leucomystax復(fù)合體的分類，發(fā)現(xiàn)其在東南亞地區(qū)有5個物種，其中，中國分布有斑腿泛樹蛙P.megacephalus、布氏泛樹蛙P.braueri、無聲囊泛樹蛙P.mutus和凹頂泛樹蛙P.impresus4個物種，模式產(chǎn)地分別是中國香港(Hallowell，1861)、中國臺灣(Vogt，1911)、緬甸N’Chang Yang(Smith，1940)和中國云南省普洱市(楊大同，饒定齊，2008)。這4個物種在中國的分布情況詳見表1(中國兩棲類，2018)。然而，泛樹蛙屬物種間的形態(tài)差異較小，繁殖模式和棲息地環(huán)境相似，其分類及分布目前仍然存在較大爭議。

表1 泛樹蛙屬物種在中國的分布Table 1 Distribution of Polypedates species in China

泛樹蛙屬物種在海南島也有分布，且體色變異較大，以往基于體色及背部有無“X”形斑等特征較難準(zhǔn)確區(qū)分該屬物種(史海濤等，2011)。由于海南島地形和植被類型較為復(fù)雜，尚無在全島范圍內(nèi)對泛樹蛙屬物種的系統(tǒng)調(diào)查，其物種多樣性及是否存在隱存種均不清楚。本研究基于全島范圍內(nèi)的系統(tǒng)樣本采集，通過分子系統(tǒng)學(xué)分析，構(gòu)建海南島泛樹蛙屬物種的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)合形態(tài)特征比較，探究海南島該屬物種多樣性與分布格局，同時通過不同物種間形態(tài)特征的詳細對比，總結(jié)可用于分類鑒定的典型形態(tài)特征，為其他地區(qū)該屬物種的分類鑒定提供依據(jù)，也為進一步開展該類群物種的景觀遺傳學(xué)和生物地理學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

研究地點位于中國海南島(108°36′45″～111°16′22″E，18°9′33″～20°9′42″N)，全島面積33 907 km2，屬低緯度熱帶季風(fēng)氣候(王寶燦，2006)。2015年7月—2017年7月，根據(jù)海南島地形及泛樹蛙屬的生境類型，在全島范圍內(nèi)選取了30個采樣點(表2，圖1)，共采集256號標(biāo)本。采用GPS記錄采集點經(jīng)度、緯度、海拔等信息，并對生境及形態(tài)拍照。

表2 泛樹蛙屬30個種群采集樣點Table 2 Sampling localities of 30 populations of Polypedates

圖1 海南島泛樹蛙屬物種調(diào)查取樣點
Fig. 1 The sampling points ofPolypedatesspecies on Hainan Island

1.2 形態(tài)鑒定與數(shù)據(jù)測量

參考《中國兩棲動物及其分布彩色圖鑒》(費梁等，2012)對采集的所有泛樹蛙標(biāo)本進行初步分類與鑒定，然后隨機選擇體長超過《中國兩棲動物及其分布彩色圖鑒》中描述的斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙成體體長最小值的115號標(biāo)本測量了形態(tài)指標(biāo)(表3)。電子天平(SI234，丹佛儀器(北京)有限公司，精度0.1 mg)稱量體質(zhì)量；數(shù)顯游標(biāo)卡尺(10810206，廣州百威獅工具有限公司，精度0.01 mm)測量體長、頭長、頭寬、吻長、鼻間距、眼間距、上眼瞼寬、眼徑、鼓膜、前臂及手長、前臂寬、后肢全長、脛長、脛寬、附足長與足長等形態(tài)指標(biāo)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3 系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系構(gòu)建

參考Kuraishi等(2013)和Pan等(2013)對東南亞地區(qū)泛樹蛙屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究，選取線粒體12SrRNA、16SrRNA基因片段作為遺傳標(biāo)記對海南島泛樹蛙屬標(biāo)本進行基因組DNA提取及目的基因擴增。擴增所用的引物序列為FS01：5’-AACGCTAAGATGAACCCTAAAAGTTCT-3’， Rend：5’-GACCTGGATTACTCCGGTCTGA-3’。以P.india、P.malaysia和P. sp.malaysia為外群，在Pan等(2013)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，加入通過形態(tài)特征初步鑒定的斑腿泛樹蛙(11個地理種群)和無聲囊泛樹蛙(4個地理種群)標(biāo)本的序列，采用貝葉斯推斷法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，以佐證形態(tài)特征鑒定的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)特征分析

對采集的標(biāo)本逐一進行詳細的形態(tài)特征比較與分析，發(fā)現(xiàn)海南島上僅分布斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙。斑腿泛樹蛙在全島范圍內(nèi)均有分布，而無聲囊泛樹蛙僅分布在海南島的吊羅山、白石嶺、五指山和尖峰嶺等中南部山區(qū)。斑腿泛樹蛙分布的最低海拔為4.9 m，海拔200 m以上為斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙的分布重疊區(qū)域?；谝韵聨讉€關(guān)鍵的形態(tài)特征能將兩者進行準(zhǔn)確分類：在體型方面，斑腿泛樹蛙身體寬而扁平，成體雄蛙體長50.28 mm±4.23 mm(n=59)，成體雌蛙體長69.36 mm±4.09 mm(n=27)，而無聲囊泛樹蛙身體窄長而扁平，成體雄蛙體長60.86 mm±4.51 mm(n=27)，成體雌蛙體長84.82 mm±3.27 mm(n=2)(表3)；在體側(cè)及其后半部斑紋方面：斑腿泛樹蛙體側(cè)無斑點，后半部有網(wǎng)紋(圖2：a)，而無聲囊泛樹蛙體側(cè)有大的黑褐色點斑綴成連續(xù)狀，體側(cè)后半部無網(wǎng)紋(圖2：c)；在股后部斑點方面：斑腿泛樹蛙股后部斑點小而密集(圖2：b)，無聲囊泛樹蛙則大而稀疏(圖2：d)。此外，斑腿泛樹蛙后肢粗壯，脛跗關(guān)節(jié)前伸達眼與鼻孔之間，而無聲囊泛樹蛙后肢細長，脛跗關(guān)節(jié)前伸達吻端或鼻孔。

2.2 海南島泛樹蛙與東南亞其他泛樹蛙的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

基于貝葉斯法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與Kuraishi等(2013)、Pan等(2013)的拓撲結(jié)構(gòu)基本一致，明顯分成了5個支系(Clade A～E)，且每個支系后驗概率較高(≥0.97)(圖3)。Clade A包含斑腿泛樹蛙模式產(chǎn)地中國香港的標(biāo)本序列，還有廣西、廣東及越南，泰國的斑腿泛樹蛙標(biāo)本序列，這些序列和所有本研究基于形態(tài)特征初步鑒定出來的海南島斑腿泛樹蛙標(biāo)本序列一起構(gòu)成了Clade A，與來自菲律賓、印度尼西亞和緬甸的P.leucomystax(Clade B)構(gòu)成了姐妹群。Clade A與Clade B一起與Clade C構(gòu)成姐妹群，Clade C包含來自老撾和中國云南的凹頂泛樹蛙。Clade D包括來自重慶、云南和廣西的布氏泛樹蛙，與前面4支構(gòu)成姐妹群。Clade E包括中國廣西和越南的無聲囊泛樹蛙以及本研究基于形態(tài)特征鑒定的海南島的無聲囊泛樹蛙種群標(biāo)本序列。通過形態(tài)特征比較和分子生物學(xué)數(shù)據(jù)分析，沒有發(fā)現(xiàn)隱存種。

表3 海南島泛樹蛙屬物種形態(tài)學(xué)特征Table 3 Morphological characteristics of Polypedates on Hainan Island

圖2 斑腿泛樹蛙側(cè)面觀(a)和股后部(b)， 無聲囊泛樹蛙側(cè)面觀(c)和股后部(d)Fig. 2 The side view (a) and posterior portion (b) of Polypedates megacephalus and the side view (c) and posterior portion (d) of P.mutus

圖3 基于線粒體12S rRNA、16S rRNA基因構(gòu)建的泛樹蛙屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹Fig. 3 Phylogenetic tree of Polypedates based on the mitochondrial 12S rRNA and 16S rRNA gene

3 討論

此前對海南島泛樹蛙屬物種的分子生物學(xué)研究僅基于海南島局部區(qū)域采集的少量標(biāo)本，并未對全島進行大范圍的采樣，由于種間特征相似，僅依靠形態(tài)或分子生物學(xué)手段得出的結(jié)果缺乏相互的佐證。因此，對海南島泛樹蛙屬物種的分類與分布格局一直存在爭議(Kuraishietal.，2013；Panetal.，2013)。本研究通過系統(tǒng)調(diào)查取樣，把在海南島采集的所有泛樹蛙屬物種樣本的線粒體12SrRNA和16SrRNA基因序列與P.leucomystax復(fù)合體已知序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)海南島所有樣本只分布在2個支系上，分別是斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙。因此，確認(rèn)了海南島僅分布有斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙。斑腿泛樹蛙在全島均有分布，而無聲囊泛樹蛙僅分布在海南島中南部山區(qū)。斑腿泛樹蛙作為海南島廣泛分布的物種，其種群的遺傳結(jié)構(gòu)特點及其可能存在的遺傳分化值得進一步研究。

斑腿泛樹蛙早期被認(rèn)為是P.leucomystax的亞種(Stejneger，1925；Pope，1931；Inger，1966)，中國學(xué)者認(rèn)為是P.leucomystax的同物異名(Liu，1950；劉承釗，胡淑琴，1961)。Matsui等(1986)通過對分布在中國臺灣和婆羅洲的種群進行比較分析，認(rèn)為斑腿泛樹蛙不是P.leucomystax的同物異名。隨后，中國的一些分類學(xué)者也認(rèn)為中國大陸的種群都是斑腿泛樹蛙(Zhao & Adler，1993；費梁，1999；費梁等，2005，2009)。Liu等(1960)在云南河口采到背部有條紋卻沒有聲囊的泛樹蛙屬的物種標(biāo)本，認(rèn)為該物種為無聲囊泛樹蛙。Inger等(1999)也認(rèn)為華南地區(qū)沒有聲囊的標(biāo)本是無聲囊泛樹蛙。楊大同和饒定齊(2008)于云南省普洱市發(fā)現(xiàn)了一泛樹蛙屬的新種，并將其命名為凹頂泛樹蛙，后來該物種的有效性也得到了分子生物學(xué)的驗證(Panetal.，2013)。Kuraishi等(2011)對斑腿泛樹蛙模式產(chǎn)地香港種群與臺灣種群的標(biāo)本在分子生物學(xué)、鳴聲特征以及形態(tài)學(xué)方面做了比較研究，認(rèn)為這2個地理種群存在明顯差異，明確了臺灣種群是布氏泛樹蛙而不是斑腿泛樹蛙。隨后一些學(xué)者通過進一步的分子系統(tǒng)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)中國分布的泛樹蛙為多個物種(Brownetal.，2010；Kuraishietal.，2013；Panetal.，2013)。本研究通過分子生物學(xué)手段，驗證了對海南島泛樹蛙屬物種鑒定所參考形態(tài)特征的準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)以往采用物種的體色和體背“X”形斑等特征不能準(zhǔn)確區(qū)分海南島的泛樹蛙屬物種。本研究通過詳細的標(biāo)本對比，認(rèn)為體型、體側(cè)斑點及其后半部網(wǎng)紋、股后部斑點和脛跗關(guān)節(jié)前伸至眼/鼻/吻端的位置等特征可作為準(zhǔn)確鑒別斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙的穩(wěn)定且典型的形態(tài)特征。運用該形態(tài)特征鑒定的結(jié)果與分子數(shù)據(jù)鑒定結(jié)果一致，這些特征可為其他分布區(qū)對這2個物種的分類鑒定提供參考。

斑腿泛樹蛙為全島廣泛分布的物種，種群數(shù)量相對較多，但無聲囊泛樹蛙僅分布于海南島中南部山區(qū)，分布區(qū)狹窄，種群數(shù)量相對較少，其棲息地為生境保存相對完好的次生林和原始雨林區(qū)，作為一個重要的環(huán)境指示物種，應(yīng)加大保護力度，降低人為干擾和棲息地破壞。

致謝：海南師范大學(xué)碩士研究生陳一帆及本科生張豪在野外采樣過程中給予幫助；北京林業(yè)大學(xué)博士研究生黃勇杰在分子生物學(xué)數(shù)據(jù)處理中給予指導(dǎo)和幫助，在此一并表示感謝。