蘇興奮 王漢東 林元相 陳伏祥

腦出血引起的繼發(fā)性腦損傷的損傷機制是多樣的，如紅細胞及降解產(chǎn)物毒性、谷氨酸興奮性毒性、氧化損傷、炎癥及細胞死亡通路激活等[1]。腦出血后數(shù)周內(nèi)血紅蛋白在腦實質(zhì)內(nèi)被氧化、降解，降解產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物如氯化血紅素（hemin）和鐵離子可持續(xù)加重腦損傷。血液中大概有2.5 mmol/L的血紅蛋白，在腦組織中降解后可產(chǎn)生約10 mmol/L的hemin[2]。Hemin是親脂性氧化劑，以很高的濃度積聚在血腫內(nèi)損傷神經(jīng)細胞。已有研究證實，3～30 μmol/L的hemin在4～14 h內(nèi)可以有效殺死60%～70%的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞[3,4]。腦出血后在血腫內(nèi)及血腫周圍出現(xiàn)大量的凋亡細胞和壞死細胞。細胞凋亡是機體在發(fā)育或病理過程中細胞主動的，由基因控制的細胞程序性死亡方式。細胞凋亡的主要特征有細胞皺縮、染色質(zhì)凝集、細胞出芽、DNA片段化及凋亡小體的產(chǎn)生。在凋亡的過程中，細胞膜保持完整，不會引起炎癥反應。已有大量的報道研究細胞凋亡在腦出血中的作用，而對于細胞壞死卻鮮有研究[1,12]。其原因可能是既往認為細胞壞死是一種意外的、不可逆的非程序性細胞死亡。然而，隨著對細胞死亡機制的不斷深入研究表明細胞壞死并不全是被動的、不受調(diào)控的，近期一些研究揭示一些細胞壞死可以是主動的，受到特定基因及信號分子的調(diào)控，這類細胞壞死稱為“necroptosis”或“程序性壞死”[5]。 程序性壞死細胞具有壞死樣的形態(tài)特征，細胞膜破壞，細胞及細胞器腫脹，線粒體膜電位缺失，引起局部炎癥反應等特征。進一步研究發(fā)現(xiàn)這個過程受RIP1和RIP3調(diào)控，并可被RIP1特異抑制劑Necrostatin-1（Nec-1）抑制[5]。已有研究證實程序性壞死在谷氨酸、NMDA誘導的神經(jīng)損傷中發(fā)揮作用[6,7]。但程序性壞死在hemin誘導的細胞損傷中的作用尚不明確。本研究利用藥物研究Nec-1在hemin誘導的HT-22細胞死亡中潛在的神經(jīng)保護作用和基因干預手段，明確RIP3在hemin誘導的HT-22細胞死亡中的作用。

材料與方法

一、細胞株與主要試劑

小鼠海馬神經(jīng)元細胞株HT-22購自ATCC（美國）。zVAD 購自 BD bioscience（美國）。Necrostatin-1、二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、 hemin、叔丁基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）、Hoechst、碘化丙啶（propidium iodide，PI）購自 Sigma（美國）。青霉素/鏈霉素雙抗、MitoSox Red、DMEM、Optimem I培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Invitrogen（美國）。Cell titer glo試劑盒購自Promega（美國）。NegativesiRNA使用siCONTROLnon-targeting siRNA，RIP3 siRNA 使 用 RIP3 ON-TARGET plus SMART pool siRNA，均購自Dharmacon（美國）。 細胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen（美國）。 小鼠 RIP3抗體 （Proscience， 美國），β-actin（Sigma-Aldrich，美國）用于Western蛋白印跡實驗。

二、細胞培養(yǎng)及分組

將HT-22細胞接種培養(yǎng)于含10%FBS（Invitrogen，美國）的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在實驗前使用0.25%胰酶消化分離HT-22細胞，培養(yǎng)基更換為2%FBS的DMEM，計數(shù)后細胞以3000個/孔接種于96孔板中。過夜后進行實驗分組（每組3個孔）及藥物處理。首先，將HT-22細胞分為4組(每組3個孔)，分別加入 0、25、50、100 μmol/L 的 hemin 處理 24 h，然后使用PI/Hoechst染色，統(tǒng)計各組細胞中PI陽性細胞的比例及細胞存活率。而后分別用DMSO、zVAD（20μmol/L）、Nec-1（30 μmol/L）、hemin（50 μmol/L）、hemin+zVAD、hemin+zVAD+Nec-1、hemin+Nec-1 和 hemin+BHA（100 μmol/L）處理 HT-22 細胞 24 h 后加 PI/Hoechst染色并統(tǒng)計PI+細胞比例，同時測定細胞存活率。

三、細胞存活率檢測

Cell titer glo試劑盒是通過檢測細胞三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平來定量細胞存活率。根據(jù)試驗試劑盒的使用說明書，在96孔板中培養(yǎng)的各實驗組細胞進行相應處理24 h后，每個需要檢測的孔內(nèi)加入30 μL的cell titer glo試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10 min，然后靜置10 min并在Wallac VictorⅡ讀板器上檢測化學發(fā)光值。

四、PI及Hoechst細胞染色

實驗組中加入PI和Hoechst，其終濃度為2 μg/mL，在培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育10 min，然后在熒光顯微鏡下每個孔分別隨機拍攝3張200倍視野的PI和Hoechst照片，使用Image J軟件進行細胞計數(shù)。 PI+（%）=PI+/Hoechst+。

五、MitoSox Red及Hoechst染色

MitoSox Red是活性氧（reactive oxy gen species,ROS）敏感的指示劑，使用MitoSox Red檢測線粒體ROS水平。在DMSO、hemin和hemin+Nec-1組細胞中分別加入MitoSox Red及Hoechst，然后在培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育10 min，然后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

六、siRNA轉(zhuǎn)染

細胞按每孔2×105個接種于6孔板過夜。將Negative和RIP3 siRNA和Lipofectamine 2000分別稀釋到等體積OptimemⅠ培養(yǎng)基中并在室溫放置平衡10 min，然后將兩者混合并輕輕混勻，在室溫放置20 min，然后將混合液加入到六孔板細胞培養(yǎng)基中，siRNA終濃度為 60 nmol/L，Lipofectamine為2 μL/mL。細胞置于培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染4 h后，加入新鮮的常規(guī)培養(yǎng)基。細胞轉(zhuǎn)染48 h后將細胞消化下來，以3000個/孔接種于96孔板過夜后進行藥物處理，分為不加 hemin刺激的對照 Control組及 50 μmol/L hemin刺激組，其余細胞培養(yǎng)至72 h后收集進行Western blot分析。

七、細胞裂解和Western blot分析

將細胞從6孔板刮下，離心機1500 r/min、4℃離心5 min，用冷PBS洗滌1次，再次離心后加入500 μL預冷的細胞裂解緩沖液，冰上用超聲細胞破碎儀超聲破碎5 s，然后置于離心機13 000 r/min、4℃離心15 min，取上清為細胞裂解液，并進行蛋白定量，然后進行Western蛋白印跡分析。取50 μg蛋白加入相應的5×上樣緩沖液，混勻后于100℃水浴變性5 min，離心后取蛋白于10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，然后將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜。將膜置于TBST配置的含5%脫脂奶粉封閉液中，室溫搖晃封閉2 h，洗滌后加入按相應比例稀釋的一抗（RIP3 1∶1000，β-actin 1∶2000），4℃包被過夜。用TBST洗滌3次，每次10 min。然后加入辣根過氧化物酶標記的與一抗對應的二抗搖晃孵育1 h，用TBST洗3次，每次10 min。隨后加入增強化學發(fā)光溶液，于暗室中用X光膠片自顯影。膠片經(jīng)顯影、定影、晾干、掃描，獲得目標蛋白條帶，分析實驗結果。用Image J軟件進一步分析條帶密度。

八、統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，使用方差分析及Tukey進行多重比較。所有實驗至少重復3次，數(shù)據(jù)表達為均數(shù)±標準差（±s），使用 GraphPad Prism5軟件進行作圖。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、Hemin誘導HT-22細胞死亡

圖1A和B所示，隨著hemin濃度的增加，PI+細胞比例也梯度增加，當hemin濃度為50 μmol/L時其PI陽性細胞比例為52.4%±6.0%。進一步使用Cell titer glo測定各組細胞ATP含量即細胞存活率。圖1C所示，隨著hemin濃度增加，HT-22細胞存活率梯度下降，50 μmol/L hemin處理使得HT-22的存活率下降到47.2%±2.8%。

二、Caspase非依賴性程序性壞死介導hemin誘導的HT-22細胞死亡

圖2所示，與DMSO組相比，hemin處理后PI+（46.0%±5.0%）顯著升高，細胞存活率（44.6%±12.7%）也顯著減低；與hemin組相比，Nec-1處理后明顯減少 PI+細胞（18.5%±14.0%），細胞存活率（76.7%±14.3%）顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。另外，與hemin組比較，hemin+zVAD并不能減低 PI+細胞（46.6%±2.3%）或提高細胞存活率（41.1%±9.9%）;而與 hemin+Nec-1組相比，hemin+zVAD+Nec-1也沒有進一步減少 PI+（16.7%±5.7%）或增加細胞存活（71.1%±14.8%），差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

三、ROS積聚介導hemin誘導的HT-22細胞死亡

圖3所示，HT-22細胞經(jīng)hemin刺激后細胞內(nèi)的ROS水平明顯升高，而Nec-1處理明顯減少了細胞內(nèi)ROS水平。進一步使用BHA處理細胞，結果顯示BHA能顯著減輕hemin誘導的細胞壞死（圖4）。

四、敲低RIP3對hemin誘導的HT-22細胞死亡的影響

使用siRNA敲低細胞中RIP3蛋白的表達，使用Western blot技術在轉(zhuǎn)染72 h后檢測細胞內(nèi)RIP3蛋白水平，結果顯示RIP3蛋白明顯下調(diào)（圖5A）。各組分別給予相應刺激24 h，行PI和Hoechst染色，如圖5B所示，RIP3敲低組PI+細胞明顯減少。進一步統(tǒng)計各組細胞PI+率及細胞存活率，結果顯示與Negative siRNA+hemin組比較，RIP3被敲低以后PI+細胞數(shù)也明顯減少（圖5C），細胞存活率明顯升高（圖 5D），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

討 論

腦出血后血液成分被釋放到腦實質(zhì)中，紅細胞降解為血紅蛋白，隨后血紅蛋白降解為hemin[12]。Hemin是親脂性氧化劑，以高達毫摩爾濃度水平積聚在血腫內(nèi)，能夠損傷多種神經(jīng)細胞，例如神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞[4,12]。本研究首次顯示hemin以濃度依賴的方式誘導HT-22的細胞死亡，并且大多數(shù)死亡細胞為PI+的壞死細胞。筆者選擇濃度為50 μmol/L的hemin進行后續(xù)實驗。

圖1 氯化血紅素劑量依賴性的誘導HT-22細胞死亡

圖2 Nec-1和zVAD對氯化血紅素誘導的HT-22細胞死亡的影響

圖3 Nec-1對氯化血紅素誘導HT-22細胞產(chǎn)生的活性氧的影響

圖4 活性氧清除劑叔丁基羥基茴香醚對氯化血紅素誘導HT-22細胞死亡的影響

程序性壞死在多種疾病中發(fā)揮作用，包括腦缺血、腦外傷、腦出血等[14-16]。程序性壞死是受調(diào)控的細胞壞死，具有壞死細胞的形態(tài)特征，其受特定的通路調(diào)控，包括RIP1和RIP3[5,13]。RIP1是程序性壞死的促發(fā)蛋白。Nec-1是RIP1的特異性抑制劑，特異性的抑制RIP1的活性[17]。既往的研究顯示Nec-1可抑制谷氨酸誘導的HT-22細胞死亡[6]。同時有研究證明Nec-1可抑制hemin誘導的星形膠質(zhì)細胞死亡[4]。新近文獻報道在hemin誘導的神經(jīng)元死亡中RIP1 mRNA和蛋白表達增加，Nec-1處理可抑制RIP1的表達和減輕細胞死亡，另外在小鼠腦出血模型中在抑制RIP1的活性可減輕細胞死亡和改善功能預后[19,20]。因此，筆者推測RIP1可能在hemin誘導的HT-22細胞死亡中起作用。本文首先研究Nec-1是否能抑制hemin誘導的HT-22細胞死亡，結果顯示hemin誘導的HT-22細胞死亡可被Nec-1抑制，卻不能被凋亡抑制劑z-VAD所抑制，表明hemin誘導的HT-22細胞死亡可能主要是通過RIP1激酶的作用。

研究證明ROS在程序性壞死的執(zhí)行中起關鍵作用[8,13]。在本文的hemin誘導HT-22神經(jīng)細胞損傷模型中，當給予hemin處理后HT-22細胞中的ROS水平顯著增高，并可以被Nec-1抑制。而hemin引起的HT-22細胞死亡可進一步被ROS清除劑BHA所抑制。Nec-1并非ROS清除劑，卻可以抑制ROS。這些結果證明ROS積聚是hemin誘導的HT-22細胞死亡的一個重要因素。RIP3的調(diào)控是TNF誘導細胞壞死的ROS的另一個重要來源[8]。RIP3和多種參與谷氨酰胺代謝和糖原分解相關的代謝酶相互作用，最終過度激活線粒體呼吸鏈，能量耗竭，并產(chǎn)生大量細胞毒性的ROS[8]。在程序性壞死中ROS的釋放極為劇烈，是細胞凋亡的幾倍甚至數(shù)十倍。大量產(chǎn)生的ROS導致脂質(zhì)過氧化、溶酶體膜通透化等，并直接損傷破壞線粒體膜、溶酶體膜及細胞膜，細胞器和細胞水腫、崩解，呈現(xiàn)細胞壞死的形態(tài)學特征，導致細胞壞死[5]。但HT-22細胞是如何通過ROS來執(zhí)行hemin誘導的程序性壞死還需要進一步研究。

圖5 敲低受體相互作用蛋白激酶3水平抑制氯化血紅素誘導HT-22細胞死亡

RIP3是調(diào)控細胞壞死的另一特異性蛋白分子[9-11]。在壞死信號刺激下，RIP3被募集到RIP1上形成穩(wěn)定的RIP1-RIP3復合物，激活RIP3下游信號通路，進而啟動程序性壞死[9-13]。因此，本研究進一步通過基因干預手段研究RIP3是否在hemin誘導的HT-22細胞死亡中也發(fā)揮作用。結果顯示在hemin誘導的HT-22死亡模型中通過siNRA敲低RIP3后壞死細胞明顯減少，細胞存活率明顯升高。已有研究報道小鼠腦出血后RIP1、RIP3蛋白表達顯著升高，相互作用形成RIP1-RIP3復合體，RIP1激酶特異性抑制劑Nec-1抑制RIP1與RIP3的相互作用，進而減輕腦血腫周圍細胞壞死，減輕腦水腫，改善神經(jīng)功能預后[16]。RIP3基因敲除可顯著地減少血腫內(nèi)和血腫周圍的壞死細胞數(shù)量[18]。這些研究表明程序性壞死及其通路RIP1/RIP3在腦出血后的繼發(fā)腦損傷中起到重要的作用。

綜上所述，RIP1和RIP3可能是hemin誘導HT-22細胞死亡的重要干預靶點，Nec-1可能是有效的治療手段，但其具體機制及療效有待于進一步研究。