高潔艷，吳佳佳，張盾

（1.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，山東 青島 266071；2.中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心，山東 青島266071；3.青島國(guó)家海洋科學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；4.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

在海洋工程設(shè)施中，往往多種金屬材料共同使用，電偶腐蝕難以避免[1,2]。由于海洋環(huán)境十分復(fù)雜，影響金屬材料電偶腐蝕的因素多種多樣，如海水的pH、溫度、溶解氧、流速、壓力等[2-6]。在這些影響因素中，微生物對(duì)金屬材料腐蝕的影響不容忽視[7-10]。據(jù)報(bào)道，微生物腐蝕所致腐蝕損失占總腐蝕損失的20%左右[11]。因此，為減少腐蝕造成的損失，對(duì)微生物腐蝕的研究刻不容緩。目前對(duì)于微生物腐蝕的研究多集中在微生物對(duì)單一金屬材料腐蝕的影響，微生物對(duì)電偶腐蝕影響的研究報(bào)道較少。Eashwar等[12]以天然海水為介質(zhì)，研究了316不銹鋼為陰極，鎳、低碳鋼、鋅分別為陽(yáng)極時(shí)的電偶腐蝕。結(jié)果顯示，以鎳為陽(yáng)極時(shí)，陰極316不銹鋼上存在致密生物膜，鎳的腐蝕加速；但以低碳鋼和鋅為陽(yáng)極時(shí)，以碳酸鈣和氫氧化鎂為主的鈣質(zhì)沉積物在316不銹鋼上快速沉積，使得生物膜密度降低，減緩了陽(yáng)極的腐蝕速率。Krogstad等[13]研究了鎳鋁銅合金與316L不銹鋼在天然海水中的電偶腐蝕，發(fā)現(xiàn)電偶電流在偶對(duì)浸泡6～10天后呈線性增長(zhǎng)，直到穩(wěn)定在12 μA/cm2，他們認(rèn)為這是陰極不銹鋼表面的生物膜催化了陰極還原反應(yīng)所導(dǎo)致的。Dexter等[14]以?shī)W氏體不銹鋼為陰極，分別以銅、碳鋼、鋁為陽(yáng)極時(shí)發(fā)現(xiàn)，在天然海水中覆蓋了生物膜的陰極比沒(méi)有覆蓋生物膜的陰極更加速了陽(yáng)極的腐蝕。由此可見，目前微生物對(duì)電偶腐蝕影響的研究多集中在以不銹鋼為陰極的研究。

隨著船舶工業(yè)的高速發(fā)展，對(duì)高強(qiáng)度船板的需求也快速增加，EH40鋼就是常用的典型船用鋼之一[15]，而B10等鎳銅合金因?yàn)榫哂辛己玫哪臀g性，所以是艦船上常用的管路材料[16-19]。因此，擬以 EH40鋼和B10銅合金為對(duì)象，利用電化學(xué)方法、表面分析方法和環(huán)境參數(shù)測(cè)定等方法研究海洋假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp.，P.sp.）對(duì) EH40/B10 電偶腐蝕的影響，從而揭示P.sp.對(duì)EH40/B10電偶腐蝕的影響機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)將 EH40鋼和 B10銅合金都加工成尺寸為10 mm×10 mm×3 mm的樣品，背面焊接銅導(dǎo)線后，預(yù)留出工作面（工作面積為1 cm2），其余部分全部用環(huán)氧樹脂密封起來(lái)。待環(huán)氧樹脂固化后，將樣品依次用240#、400#、800#的砂紙打磨，之后用蒸餾水沖洗，再經(jīng)無(wú)水乙醇超聲清洗，冷風(fēng)吹干。最后用錫紙緊密包裹后，在立式壓力蒸汽滅菌鍋中 121 ℃下高溫高壓滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)介質(zhì)

實(shí)驗(yàn)以2216E 液體培養(yǎng)基（1 L海水中加入5 g胰蛋白胨、1 g酵母粉和0.01 g高磷酸鐵）為介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)前，將配制好的2216E液體培養(yǎng)基在立式壓力蒸汽滅菌鍋中121 ℃下高溫高壓滅菌20 min，然后冷卻至室溫。在無(wú)菌對(duì)照體系中，直接以滅菌后的2216E液體培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)介質(zhì)；在有菌體系中，以接入假交替單胞菌的2216E液體培養(yǎng)基為介質(zhì)。將無(wú)菌和有菌體系都置于室溫環(huán)境中，并且對(duì)有菌體系每天更換1/2體積的新鮮培養(yǎng)基，以確保假交替單胞菌在實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)穩(wěn)定生長(zhǎng)。

1.3 電化學(xué)測(cè)試

利用 Gamry3000電化學(xué)工作站對(duì)樣品的電偶電位、電偶電流以及開路電位（OCP）進(jìn)行測(cè)試，其中電偶電位和電偶電流的測(cè)試參照 GB/T 15748—2013《船用金屬材料電偶腐蝕試驗(yàn)方法》[20]，電極間距為7 cm，面積比為1:1，平時(shí)用銅導(dǎo)線連接，測(cè)試時(shí)斷開連接。測(cè)試采用三電極體系，其中EH40和B10為工作電極，石墨電極為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極。

1.4 腐蝕形貌觀察和生物膜表征

使用掃描電子顯微鏡（SEM，JSM-6700F）對(duì)浸泡21天后的樣品進(jìn)行腐蝕形貌觀察。無(wú)菌體系中的樣品取出后用氮?dú)獯蹈桑芯w系中的樣品取出后，先用體積分?jǐn)?shù)為 2.5%的戊二醛溶液浸泡 1～2 h以固定微生物，之后依次使用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%、100%的無(wú)水乙醇浸泡脫水 15 min，最后進(jìn)行干燥和噴金。去除腐蝕產(chǎn)物后的樣品經(jīng)無(wú)水乙醇超聲清洗干燥后直接進(jìn)行觀察。用于生物膜表征的樣品，在體積分?jǐn)?shù)為 2.5%的戊二醛溶液中浸泡 1～2 h后使用磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行漂洗，然后浸入加有DAPI（5 mg/L）和 ConA-Texas Red（200 mg/L，與多糖結(jié)合）的PBS溶液中染色15 min。取出試樣后用 0.1 mol/L碳酸氫鈉溶液清洗，之后浸泡入加有FITC（0.001%，與蛋白質(zhì)結(jié)合）的碳酸氫鈉溶液中染色15 min。最后將試樣取出用PBS漂洗去除未結(jié)合的染料，用于激光共聚焦顯微鏡（CLSM，LSM 710）觀察。

1.5 環(huán)境參數(shù)測(cè)定

對(duì)有菌體系中的 P.sp.用 2216E固體培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行定量。對(duì)兩種體系的溶解氧濃度（DO）和pH分別使用溶解氧儀（Thermo Orion 5-star）和pH 計(jì)（PHS-3C）進(jìn)行測(cè)定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 電化學(xué)結(jié)果

由圖1可以看出，無(wú)菌和有菌體系中EH40/B10電偶對(duì)在浸泡初期，電偶電位都迅速負(fù)移，后逐漸趨于穩(wěn)定，最后無(wú)菌體系中電偶電位穩(wěn)定在-415 mV左右，有菌體系電偶電位穩(wěn)定在-480 mV左右，有菌體系的電偶電位比無(wú)菌體系負(fù)移了65 mV左右。由圖2可以看出，由于電偶對(duì)在剛浸入無(wú)菌或有菌溶液的第一天反應(yīng)活性較大，無(wú)菌和有菌體系中的電偶電流都隨時(shí)間迅速減小。隨后無(wú)菌體系中的電偶電流在10～15 μA/cm2范圍內(nèi)波動(dòng)變化，有菌體系電偶電流則在 0.05～0.2 μA/cm2范圍內(nèi)波動(dòng)變化，二者相差近百倍。說(shuō)明EH40/B10電偶對(duì)在無(wú)菌體系中的電偶腐蝕速率遠(yuǎn)大于在有菌體系中的電偶腐蝕速率，即無(wú)菌體系中 EH40的陽(yáng)極溶解速率要遠(yuǎn)大于有菌體系中EH40的陽(yáng)極溶解速率。

為了進(jìn)一步研究P.sp.對(duì)EH40/B10電偶腐蝕的影響，實(shí)驗(yàn)還分別測(cè)試了無(wú)菌和有菌條件下各金屬電極的開路電位。由圖3可以看出，無(wú)論EH40和B10是否偶接，無(wú)菌體系中EH40和B10的開路電位都分別比有菌體系中EH40和B10的開路電位要正。

兩種體系中未偶接 EH40、B10的開路電位以及電偶電位如圖4所示?？梢钥闯?，無(wú)菌體系中，電偶電位靠近EH40的自腐蝕電位；有菌體系中，電偶電位幾乎與EH40的自腐蝕電位重合。說(shuō)明在有菌條件下，偶對(duì)中EH40的腐蝕情況可以看作是發(fā)生了自腐蝕，因而電偶腐蝕效應(yīng)不明顯。

無(wú)菌和有菌體系中，偶接斷開后，B10與EH40的開路電位之差（電偶腐蝕的理論驅(qū)動(dòng)電壓）隨時(shí)間的變化如圖5所示?？梢钥闯?，雖然剛浸入溶液時(shí)，可能由于電極表面反應(yīng)活性高，以及有菌體系的氧含量還較高，無(wú)菌體系的電位差小于有菌體系。1天之后，無(wú)菌體系中的電位差明顯大于有菌體系，無(wú)菌體系的電位差隨浸泡時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增大，最后穩(wěn)定在200 mV左右，有菌體系的電位差隨時(shí)間逐漸減小，最后穩(wěn)定在30 mV左右。由此可見，體系達(dá)到穩(wěn)定后EH40/B10偶對(duì)在無(wú)菌體系中發(fā)生電偶腐蝕的理論驅(qū)動(dòng)電壓比在有菌體系大170 mV左右，說(shuō)明EH40/B10偶對(duì)在無(wú)菌體系中比在有菌體系中有更大的電偶腐蝕傾向。這與圖2中無(wú)菌體系中電偶電流更大的結(jié)果是一致的，說(shuō)明在含有 P.sp.的有菌體系中電偶腐蝕受到了抑制。

2.2 腐蝕形貌觀察

EH40分別在無(wú)菌和有菌體系中浸泡 21天去除腐蝕產(chǎn)物前后的SEM圖如圖6所示?？梢钥闯?，無(wú)菌體系中偶接和未偶接的EH40表面都覆蓋了大量的腐蝕產(chǎn)物，而有菌體系中腐蝕產(chǎn)物則相對(duì)較少，覆蓋了一層致密的桿狀細(xì)菌，也就是 P.sp.。去除腐蝕產(chǎn)物后可以明顯看到，無(wú)論EH40是否偶接，無(wú)菌體系中的EH40都要比有菌體系腐蝕嚴(yán)重。B10分別在無(wú)菌和有菌體系中浸泡21天去除腐蝕產(chǎn)物前后的SEM圖如圖7所示?？梢钥闯?，無(wú)菌體系中未偶接的B10比偶接腐蝕得更嚴(yán)重，而有菌體系中偶接與未偶接的B10腐蝕情況幾乎相同。利用CLSM對(duì)有菌體系中浸泡21天后電極表面的生物膜表征結(jié)果如圖8所示，可以看出，無(wú)論是否偶接，EH40和B10表面都覆蓋了一層致密的生物膜，且EH40表面的生物膜比B10表面的生物膜相對(duì)更加致密。

2.3 環(huán)境參數(shù)分析

從圖9可看出，由于P.sp.剛接入體系6 h時(shí)，還處于快速生長(zhǎng)繁殖的階段，所以數(shù)量較少，之后數(shù)量基本維持在105～107cfu/mL。由圖10和圖11可知，無(wú)菌體系中溶解氧的含量始終在7 mg/L附近波動(dòng)變化，pH也始終維持在7.5左右；而有菌體系中6 h時(shí)溶解氧含量在6 mg/L左右，之后由于P.sp.大量繁殖，新陳代謝消耗氧氣，體系中的溶解氧含量迅速下降，3天后基本穩(wěn)定在1 mg/L左右。由此推斷P.sp.可通過(guò)新陳代謝消耗氧氣來(lái)抑制電偶腐蝕。同時(shí)，有菌體系中pH的變化與溶解氧含量的變化基本一致，說(shuō)明P.sp.的生命活動(dòng)使得溶液pH降低，偏酸性。

3 分析與討論

將浸入無(wú)菌或有菌2216E液體培養(yǎng)基中的EH40和B10用銅導(dǎo)線連接，形成短路原電池。由圖4可知，無(wú)論是在無(wú)菌體系還是有菌體系中，EH40的自腐蝕電位均低于B10，因此在EH40/B10電偶對(duì)中，EH40一方面發(fā)生自腐蝕，另一方面與B10偶接后作為陽(yáng)極加速溶解，而B10作為陰極受到保護(hù)。在不考慮溶液中含有Cu2+的情況下，EH40/B10腐蝕原電池的陰、陽(yáng)極的反應(yīng)分別為：O2+2H2O+4e→4OH-，F(xiàn)e → Fe2++ 2e。

在有菌體系中，因?yàn)槊刻鞙y(cè)試結(jié)束后更換1/2體積的新鮮培養(yǎng)基，所以 P.sp.的數(shù)量一直維持在較高的水平，但是由于 P.sp.通過(guò)呼吸作用不斷消耗體系中的氧氣，致使有菌體系中溶解氧濃度遠(yuǎn)低于無(wú)菌體系中的溶解氧濃度。由此說(shuō)明了相比于無(wú)菌體系，有菌體系中去極化劑氧的陰極還原反應(yīng)速率受到了限制，進(jìn)而抑制了陽(yáng)極反應(yīng)。因此，有菌體系中的電偶電流遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于無(wú)菌體系，即有菌體系的電偶腐蝕速率遠(yuǎn)小于無(wú)菌體系。

與此同時(shí)，對(duì)于單一金屬而言，當(dāng)溶解氧濃度較低時(shí)，溶解氧作為去極化劑使陰極極化程度增加，從而導(dǎo)致金屬的自腐蝕電位負(fù)移。因此有菌體系中未偶接或者偶接斷開后EH40的開路電位都要比無(wú)菌體系偏負(fù)，同樣有菌體系中未偶接或者偶接斷開后 B10的開路電位也都要比無(wú)菌體系偏負(fù)。EH40和B10的開路電位在有菌體系中的負(fù)移程度不一樣，有菌體系中偶接斷開后 B10開路電位的負(fù)移程度要大于EH40。由圖 5可知，有菌體系中電偶腐蝕的理論驅(qū)動(dòng)電壓遠(yuǎn)小于無(wú)菌體系，由此進(jìn)一步說(shuō)明了有菌體系的電偶腐蝕傾向遠(yuǎn)小于無(wú)菌體系。

進(jìn)一步根據(jù)浸泡21天后電極的腐蝕形貌可以看出，在無(wú)菌體系中，雖然未偶接和偶接的EH40腐蝕形貌接近，但偶接B10比未偶接B10腐蝕得更輕，說(shuō)明在無(wú)菌體系中偶接B10受到了陰極保護(hù)。在有菌體系中，無(wú)論是否偶接，EH40和B10表面都形成了一層致密的生物膜，并且有菌體系中EH40偶接與未偶接的腐蝕形貌比較接近，B10偶接與未偶接腐蝕形貌也比較接近。這進(jìn)一步說(shuō)明了在有菌體系中 EH40的電偶腐蝕效應(yīng)不明顯，可以看作發(fā)生自腐蝕，這與圖4有菌體系中的電偶電位幾乎與EH40的自腐蝕電位重合的結(jié)果一致。綜上可知，含有 P.sp.的有菌體系中，電偶腐蝕受到了抑制，雖然 P.sp.的生命活動(dòng)使溶液pH降低，但其對(duì)腐蝕的促進(jìn)作用要小于保護(hù)性生物膜和呼吸耗氧對(duì)腐蝕的抑制作用。

4 結(jié)論

1）EH40/B10在無(wú)菌體系中的電偶腐蝕速率遠(yuǎn)大于在有菌體系，主要是因?yàn)?P.sp.呼吸作用消耗氧氣以及在電極表面形成生物膜，從而抑制了電偶腐蝕。

2）在無(wú)菌體系中，偶接B10受到了陰極保護(hù)，比未偶接的B10腐蝕得輕；而在有菌體系中，是否偶接對(duì)EH40和B10的腐蝕影響不大，電偶腐蝕效應(yīng)不明顯。