王常安，劉紅柏，徐奇友，李晉南，王連生，趙志剛，尹家勝

(中國水產科學研究院黑龍江水產研究所， 黑龍江 哈爾濱 150070)

目前，世界上2/3的魚粉用來生產水產飼料[1]，隨著水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，魚粉的需求量逐漸增大，漁業(yè)資源的有限性推高了魚粉的價格。為滿足水產養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要，常用植物蛋白替代水產飼料中一定比例的魚粉[2-5]。大豆蛋白氨基酸較為平衡，分布廣泛，成本較低，是優(yōu)質的蛋白源[6]。然而，大豆蛋白中含有一些抗營養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白、皂甙等[7]，致使消化率、適口性和利用率降低[8]。飼料中大豆蛋白含量較高時，魚類的腸道、肝臟會發(fā)生炎癥反應，甚至損傷組織結構[9-10]，如大西洋鮭Salmosalar發(fā)生腸道絨毛變短，固有層和黏膜層腫脹，腸道上皮細胞空泡化等癥狀[11-12]，但牙鲆Paralichthysolivaceus[13]等卻未表現(xiàn)出明顯的癥狀，因此，此種情況也具有種屬差異性。

哲羅魚Huchotaimen生長速度較快，經濟價值較高，是中國珍稀名貴的土著鮭科魚類。目前，有關其蛋白質[14]、脂肪[14]、肌醇[15]、磷[16]等營養(yǎng)素的需要量已確定，但關于其對原料利用的資料有限。哲羅魚為肉食性魚類，對蛋白質的需求量高，喜好動物蛋白。前期研究表明，大豆分離蛋白替代魚粉后，其生長減緩，成活率和飼料利用率降低[17]。本試驗在前期試驗的基礎上，研究了大豆分離蛋白替代魚粉后對哲羅魚腸道和肝臟的組織結構和消化酶活性的影響，旨在從消化生理方面解釋其生長受抑制的原因，為配制其飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

哲羅魚初始體質量為(6.90±0.04)g。大豆分離蛋白購自哈爾濱高科技(集團)股份有限公司。選取體質健康、規(guī)格一致的哲羅魚放入室內流水系統(tǒng)，用基礎飼料馴養(yǎng)14 d后開展養(yǎng)殖試驗。

1.2 方法

1.2.1 試驗飼料的配制 試驗飼料以魚粉、大豆分離蛋白、小麥面筋、玉米蛋白粉、血粉為蛋白源，以魚油、豆油和磷脂為脂肪源。對照組G1飼料中含有40%魚粉，處理組G2～G8飼料中以大豆分離蛋白替代25.0%、37.5%、50.0%、62.5%、75.0%、87.5%和100.0%的魚粉，8種等氮等能試驗飼料的配方及營養(yǎng)水平見表1。原料均過80目篩后用鼓型混合機混合，膨化制粒(直徑為1.5 mm)，于冰箱(-20 ℃)中保存待用。

表1 試驗飼料配方及營養(yǎng)水平(風干基礎)Tab.1 Ingredient and approximate composition of the basical diet used in the experiment (air-dry basis) w/%

注： 1)其他成分包括次粉22.3%、 血粉5.0%、 小麥面筋5.0%、 玉米蛋白10.0%、 豆油7.0%、 磷脂2.0%、 預混劑1.20%；2)預混劑包括甜菜堿0.1%、 膽堿0.2%、 防霉劑 0.05%、 抗氧化劑 0.025%、 VC 0.1%、 復合維生素0.1%、 復合微量元素0.5%； 3)維生素和微量元素包括VA 15 000 IU/kg、 VD33000 IU/kg、 VE 60 mg/kg、 VK35 mg/kg、 VB115 mg/kg、 VB230 mg/kg、 VB615 mg/kg、 VB120.5 mg/kg、 煙酸 175 mg/kg、 葉酸5 mg/kg、 泛酸鈣 50 mg/kg、 生物素 2.5 mg/kg、 肌醇1000 mg/kg、 碘 0.6 mg/kg、 錳 15 mg/kg、 銅 3 mg/kg、 鐵25 mg/kg

Note： 1)In each diet,the followings are supplied: wheat flour middling 22.3%, blood meal 5.0%,wheat gluten 5.0%, corn gluten meal 10.0%, soy oil 7.0%, soy lecithin 2.0%, premix 1.20%;2)Premix includes betaine 0.1%, choline 0.2%, antimildew 0.05%, antioxidant 0.025%, VC 0.1%, vitamin premix 0.1%; mineral premix 0.5%; 3)Vitamin premix and mineral premix include VA 15 000 IU/kg, VD33000 IU/kg, VE 60 mg/kg, VK35 mg/kg, VB115 mg/kg, VB230 mg/kg, VB615 mg/kg, VB120.5 mg/kg, nicotinic acid 175 mg/kg, folic acid 5 mg/kg, calcium pantothenate 50 mg/kg, biotin 2.5 mg/kg, inositol 1000 mg/kg, I 0.6 mg/kg, Mn 15 mg/kg, Cu 3 mg/kg, and Fe 25 mg/kg

1.2.2 試驗設計及飼養(yǎng)管理 試驗設8個處理組(G1～G8)，每個處理組設3個重復，每個重復放100尾魚。試驗在室內玻璃鋼水族箱(220 L)中進行。試驗水為涌泉水，水溫為9.8～16.2 ℃，溶氧>8.0 mg/L。日投喂2次，前4周投飼率為魚體質量的3.4%，后4周投飼率為魚體質量的2.0%，養(yǎng)殖周期為56 d。

1.2.3 樣品采集 養(yǎng)殖試驗結束后，將魚饑餓24 h，用苯氧乙醇(0.05%)麻醉，采集樣本。從每個重復隨機取4尾魚，于冰盤上取胃、腸道(剔除內含物和脂肪)和胰腺組織，用冰浴生理鹽水(0.86%)洗凈，濾紙吸干，稱重。按質量體積比為1∶9(g∶mL)加入預冷的生理鹽水，用FJ-200CL高速組織勻漿機勻漿3 min(15 000 r/min)，在4 ℃條件下以4 000 r/min離心10 min，取上清液放入1.5 mL離心管中，于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存，用于測定前腸、中腸、后腸和胰腺的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。

1.2.4 消化酶活性測定及組織切片觀察 消化酶活性測定：分別采用福林-酚法、聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法和淀粉-碘比色法測定蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性[18]。

組織切片：從每個重復隨機取4尾魚的肝臟、前腸、中腸和幽門盲囊，在Bouin’s液中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，用KD1508型切片機橫向連續(xù)切片，切片厚度為6 μm，用蘇木精-伊紅染色法染色，中性樹膠封片，在Olympus光學顯微鏡下測定中腸的絨毛高度和紋狀緣的高度。每張切片測定10個腸絨毛和紋狀緣高度。

1.3 數據處理

試驗數據均以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用SPSS for Windows 23.0軟件進行單因素方差分析和Duncan’s多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 大豆分離蛋白替代魚粉對哲羅魚蛋白酶活性的影響

從表2可見：隨著飼料中大豆分離蛋白質水平的增加，哲羅魚胃、前腸+幽門盲囊、中腸和胰腺的蛋白酶活性明顯下降；各魚粉替代組魚的胃、前腸+幽門盲囊蛋白酶活性均顯著低于對照組(P<0.05)，當魚粉替代水平大于87.5%及以上時，中腸和胰腺蛋白酶活性均顯著低于對照組(P<0.05)。

表2大豆分離蛋白替代魚粉對哲羅魚蛋白酶活性的影響

Tab.2EffectsoffishmealreplacementbysoybeanproteinisolateonproteaseactivitiesoftaimenHuchotaimen

U/g prot

注：同列中標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同

Note： The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

2.2 大豆分離蛋白替代魚粉對哲羅魚脂肪酶活性的影響

從表3可見：隨著飼料中大豆分離蛋白水平的增加，哲羅魚胃、前腸+幽門盲囊、中腸和胰腺的脂肪酶活性明顯下降；各魚粉替代組魚的前腸+幽門盲囊中脂肪酶活性顯著低于對照組(P<0.05)，當魚粉替代水平為75.0%及以上時，胃、中腸、胰腺脂肪酶活性均顯著低于對照組(P<0.05)。

表3大豆分離蛋白替代魚粉對哲羅魚脂肪酶活性的影響

Tab.3EffectsoffishmealreplacementbysoybeanproteinisolateonlipaseactivitiesoftaimenHuchotaimen

U/g prot

2.3 大豆分離蛋白替代魚粉對哲羅魚淀粉酶活性的影響

從表4可見：隨著飼料中大豆分離蛋白水平的增加，哲羅魚胃、前腸+幽門盲囊、中腸和胰腺的淀粉酶活性明顯下降；各魚粉替代組魚的胃淀粉酶活性顯著低于對照組(P<0.05)，當魚粉替代水平為87.5%及以上時前腸+幽門盲囊、胰腺中淀粉酶活性顯均著低于對照組(P<0.05)。

2.4 大豆分離蛋白替代魚粉對哲羅魚消化組織形態(tài)的影響

從表5可見：隨著飼料中大豆分離蛋白質水平的增加，哲羅魚中腸絨毛和紋狀緣高度明顯下降；當魚粉替代水平為37.5%及以上時，腸絨毛和紋狀緣高度均顯著低于對照組(P<0.05)。

對照組哲羅魚肝細胞排列較為整齊，細胞界限明顯，細胞核清晰可見(圖1-A)；隨著大豆分離蛋白質水平的增加，肝臟組織結構呈現(xiàn)不同程度的破壞，出現(xiàn)病理現(xiàn)象(圖1-B)；替代水平為100.0%時，肝臟空泡化現(xiàn)象嚴重，形態(tài)輪廓逐漸模糊，肝細胞核發(fā)生偏移，部分逐漸溶解或缺失(圖1-C)。觀察發(fā)現(xiàn)，對照組哲羅魚前腸、中腸和幽門盲囊的上皮組織結構完整，絨毛發(fā)達，上皮細胞排列整齊，杯狀細胞較多(圖1-D、G、J)；隨著魚粉替代水平的增加，組織結構呈現(xiàn)不同程度的破壞，當魚粉替代水平為75%時，開始出現(xiàn)病理現(xiàn)象，組織結構完整性被破壞，部分紋狀緣融合、脫落(圖1-E、H、K)；替代水平為87.5%和完全替代時表現(xiàn)的病理特征類似(選取完全替代水平的病理切片圖說明)，組織結構被破壞，紋狀緣脫落嚴重(圖1-F、I、L)。

表4大豆分離蛋白替代魚粉對哲羅魚淀粉酶活性的影響

Tab.4EffectsoffishmealreplacementbysoybeanproteinisolateonamylaseactivitiesoftaimenHuchotaimen

U/g prot

表5大豆分離蛋白替代魚粉對哲羅魚腸道形態(tài)的影響

Tab.5EffectsoffishmealreplacementbysoybeanproteinisolateonintestinalmorphologyoftaimenHuchotaimen

μm

3 討論

3.1 大豆分離蛋白替代魚粉對哲羅魚消化酶活性的影響

飼料中以大豆蛋白為主要蛋白源時，其含有的抗營養(yǎng)因子影響了魚體對蛋白質的吸收和利用。本研究表明，隨著大豆分離蛋白替代水平的增加，哲羅魚胃、前腸、幽門盲囊、中腸和胰腺的蛋白酶活性下降。對虹鱒Oncorhynchusmykiss[19]、大西洋鮭Salmosalar[20]等的研究中，也表現(xiàn)出類似的變化規(guī)律。大豆蛋白影響魚體蛋白酶活性的機理是抗營養(yǎng)因子(如胰蛋白酶抑制因子)影響胰腺的發(fā)育，蛋白酶的合成與分泌量減少，或者其與蛋白酶結合使腸道蛋白酶活性降低[20]。

飼料中高比例大豆產品替代魚粉后，舌齒鱸Dicentrarchuslabrax[21]、珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)[22]等腸道的脂肪酶和淀粉酶活性降低，與本試驗結果類似。劉文斌等[23]認為，這可能是腸道內部小肽和游離氨基酸的含量增加，消化酶所作用的底物減少，從而降低了內源酶的需要量，此反饋調節(jié)了消化酶的表達量。有些魚類對大豆蛋白的適應性反應有所不同。如翹嘴紅鲌Erythroculterilishaeformis[24]腸道蛋白酶活性隨著大豆蛋白替代魚粉比例的增加而降低，腸道脂肪酶和淀粉酶未出現(xiàn)明顯變化。埃及胡子鲇Clariasleather腸道脂肪酶亦未發(fā)生明顯變化[25]。這些結果的差異，不僅與魚的種類、食性有關，還與大豆產品的種類等試驗條件不同有關。

3.2 大豆分離蛋白替代魚粉對哲羅魚消化系統(tǒng)組織結構的影響

飼料中添加高比例的大豆蛋白后，魚類腸道的組織形態(tài)發(fā)生了變化。豆粕替代魚粉后，埃及胡子鲇腸道絨毛高度有所下降[25]；大豆分離蛋白替代魚粉也會引起幼建鯉Cyprinuscarpiovar. Jian腸絨毛高度降低，消化吸收能力減弱[26]。本研究結果顯示，高比例(替代水平>75%)的大豆蛋白替代魚粉后，腸道的絨毛和微絨毛高度顯著下降，這可能與大豆蛋白中的抗原分子抑制腸細胞的生長發(fā)育有關。

魚類腸道結構受損后，會發(fā)生黏膜炎癥反應，消化吸收能力下降，生長性能降低。飼料中高比例大豆蛋白替代魚粉后，大西洋鮭[27-28]、虹鱒[29]、大西洋鰈Hippoglossushippoglossus[30]等腸道上皮完整性和正常形態(tài)結構受到破壞后，會發(fā)生腸道上皮脫落、結締組織數量增加、黏膜固有層和黏膜下層細胞核排列紊亂、炎性細胞(淋巴細胞、巨噬細胞和多核細胞)浸潤等。雜食性魚類鯉攝食豆粕和大豆分離蛋白替代魚粉飼料時，前腸和后腸的完整性也會受到破壞，出現(xiàn)腸上皮細胞脫落等形態(tài)改變[26]。吳莉芳等[31]認為，這可能是上皮細胞表面的特異性受體與大豆中的某些致敏原結合，導致腸黏膜出現(xiàn)炎癥反應所致。

注：A為對照組肝臟；B為75.0%替代組肝臟；C為100.0%替代組肝臟；D為對照組幽門盲囊；E為75.0%替代組幽門盲囊；F為100.0%替代組幽門盲囊；G為對照組前腸；H為75.0%替代組前腸；I為100.0%替代組前腸；J為對照組中腸；K為75.0%替代組中腸；L為100.0%替代組中腸(100×)。M為紋狀緣; G為杯狀細胞; EC為上皮細胞Note: A, liver in control group; B, liver in the 75.0% replacement group; C, liver in the 100.0% replacement group; D, pyloric caeca in control group; E, pyloric caeca in the 75.0% replacement group; F, pyloric caeca in the 100.0% replacement group; G, foregut in control group; H, foregut in the 75.0% replacement group; I, foregut in the 100.0% replacement group; J, midgut in control group; K, midgut in the 75.0% replacement group; L, midgut in the 100.0% replacement group (100×). M，Microvilli; G，Goblet cells; EC，Epithelial cells圖1 大豆分離蛋白替代魚粉對哲羅魚腸道和肝臟形態(tài)的影響Fig.1 Effects of fish meal replacement by soybean protein isolate on intestinal and hepatic morphology of taimen Hucho taimen

飼料中大豆蛋白高比例替代魚粉后，大黃魚Larimichthyscrocea[32]、鱸Lateolabraxjaponicus[33]等肉食性魚類的腸道組織和肝臟會出現(xiàn)明顯的結構性病變。本研究表明，當大豆分離蛋白替代魚粉至75%時(含魚粉10%)，哲羅魚腸道絨毛明顯稀疏且出現(xiàn)空泡，肝細胞明顯減少，且細胞核大量融解，甚至消失。這可能與大豆分離蛋白中的胰蛋白酶抑制因子、凝集素、皂甙等抗營養(yǎng)因子抑制腸道和肝臟細胞的發(fā)育有關，腸道和肝臟組織也因此受到破壞。對金頭鯛Sparusaurata[34]、大黃魚[32]等研究也表明，肝發(fā)生病變時，還會出現(xiàn)脂肪蓄積。其原因一是脂蛋白合成減少，肝細胞內的脂肪不能及時轉運出來，二是大豆蛋白中的毒性物質引起的脂肪代謝失調。

3.3 大豆分離蛋白替代魚粉對哲羅魚生長抑制的消化生理機制

前期研究表明，與其他肉食性魚類如南方鲇Silurusmeridionalis[35]等類似，飼料中用大豆分離蛋白替代魚粉比例增加時，哲羅魚的生長性能下降，當替代魚粉的比例超過60%時，其生長率、飼料轉化率和蛋白質沉積率極顯著下降[17]。這可能是由于大豆蛋白中的抗營養(yǎng)因子阻礙營養(yǎng)物質消化吸收，以及其氨基酸比例不平衡所引起的[36]。從本試驗結果來看，大豆蛋白中的抗營養(yǎng)因子抑制了哲羅魚肝臟、腸道的發(fā)育，高比例替代魚粉(>75.0%)時，甚至導致其結構性病變，引起蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶分泌量減少，進而減少了魚體對營養(yǎng)物質的消化吸收。因此，飼料中采用大豆分離蛋白替代魚粉的過程中，需要采用適當地去抗營養(yǎng)因子的方法以提高其利用率。