段智紅,袁圣亮,呂應(yīng)年,2,*,吳科鋒,2

(1.廣東海洋醫(yī)藥研究院,廣東醫(yī)科大學(xué),廣東湛江 524023; 2.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東醫(yī)科大學(xué),廣東湛江 524023)

海藻是一類重要的海洋生物資源,目前國(guó)際應(yīng)用的海藻年工業(yè)產(chǎn)值達(dá)到50億美元以上,其中90%用作人類食品補(bǔ)充物質(zhì)[1]?？墒承院Ｔ迥芴峁﹥?yōu)良的多糖、蛋白質(zhì)、脂肪酸、礦物質(zhì)、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分,成為沿海居民普遍食用的海洋風(fēng)味食品來(lái)源,尤其在亞洲國(guó)家,包括中國(guó)、日本、韓國(guó)、泰國(guó)等,每年消費(fèi)大量海藻類食品。我國(guó)是海藻消費(fèi)大國(guó),其中紫菜、龍須菜(也稱海發(fā)菜)以及海帶等大型可食用海藻年產(chǎn)量數(shù)以千噸計(jì)[2-3]。

可食用大型海藻不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),還含有多種天然色素,按照藻體的外觀顏色可把這些可食用海藻分為三類:紅藻(Rhodophyta)、綠藻(Chlorophyta)和褐藻(Ochrophyta)。海藻中的天然色素主要包括葉綠素類(Chlorophyll)、胡蘿卜素類(Carotenoids)以及藻膽蛋白類(藻紅蛋白Phycoerythrin、藻藍(lán)蛋白Phycocyanin)等有色成分[4-6]。其中葉綠素是海藻進(jìn)行光合作用的主要色素,在海藻中含量豐富,具有多種生物功能。葉綠素作為海洋食品的功能性成分,研究其結(jié)構(gòu)、含量、分布以及生理活性對(duì)于人類健康具有重要意義。

近年來(lái),人們對(duì)葉綠素及其衍生物的化學(xué)成分、生物活性、測(cè)定方法、生物合成及臨床應(yīng)用等方面進(jìn)行了大量研究[7-9],本文選取消費(fèi)量居前的六種可食性大型海藻,包括紅藻類海發(fā)菜(Gracilarialemaneiformis)和紫菜(Porphyra,Nori),褐藻類海帶(Laminaria,Kombu)和裙帶菜(Undaria,Wakame),以及綠藻類滸苔(Enteromorpha,Aonori)和石莼(Ulva,Sea lettuce),綜述這些海藻中葉綠素及衍生物的分布、結(jié)構(gòu)及活性,為我國(guó)海藻經(jīng)濟(jì)的發(fā)展提供參考。

1 海藻中葉綠素及其衍生物的種類和含量

海藻中的葉綠素在光合作用的光吸收中起核心作用,其吸收大部分的紅光和紫光,并反射綠光,因此葉綠素自身呈現(xiàn)綠色。海藻中葉綠素衍生物的種類及含量和生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。海藻生長(zhǎng)區(qū)域的海水溫度、氮磷含量、光照強(qiáng)度、光照時(shí)間等因素會(huì)對(duì)海藻葉綠素及其衍生物產(chǎn)生影響[10]。江籬屬海藻龍須菜在富氮環(huán)境中,會(huì)吸收過(guò)量的氮儲(chǔ)存在體內(nèi),當(dāng)環(huán)境中缺乏氮源時(shí),體內(nèi)的氮會(huì)慢慢釋放出來(lái),供應(yīng)海藻生長(zhǎng)及生理需求,此時(shí)龍須菜藻體內(nèi)的色素含量下降,藻體出現(xiàn)“黃化”現(xiàn)象,光合同化效率下降[11],表明環(huán)境因素的改變會(huì)導(dǎo)致海藻的葉綠素含量發(fā)生改變,也從側(cè)面反映出海藻中的葉綠素成分復(fù)雜多變。

由于可食性海藻的物質(zhì)成分對(duì)人體健康有影響,準(zhǔn)確分析海藻中化學(xué)成分含量及結(jié)構(gòu)具有重要意義?，F(xiàn)代化的分離純化技術(shù)和儀器分析手段為檢測(cè)海藻中的化學(xué)成分提供了技術(shù)保障?？墒承院Ｔ逶辖?jīng)有機(jī)溶劑提取分離、柱層析純化得到各種葉綠素衍生物。葉綠素類衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定方法主要有高效液相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-TOF-MS),考慮到檢測(cè)化合物的極性,質(zhì)譜檢測(cè)的離子源采用電噴霧(ESI)和大氣壓化學(xué)電離源(APCI)。六種常見可食性大型海藻中的葉綠素及衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)已被鑒定,化合物種類和含量結(jié)果如表1[12-13]所示。

表1 可食性海藻的葉綠素及其衍生物種類及含量Table 1 Varieties and contents of chlorophyll and its derivatives in edible

2 海藻中葉綠素及其衍生物的結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)化

葉綠素分子是由兩部分組成的:核心部分是一個(gè)卟啉環(huán)(Porphyrin ring),其功能是光吸收;另一部分是一個(gè)很長(zhǎng)的脂肪烴側(cè)鏈,稱為植醇(葉綠醇,Phytol),葉綠素用這種側(cè)鏈插入到類囊體膜。與含鐵的血紅素基團(tuán)不同的是,葉綠素卟啉環(huán)中含有一個(gè)鎂原子。葉綠素分子通過(guò)卟啉環(huán)中單鍵和雙鍵的改變來(lái)吸收可見光。鎂原子居于卟啉環(huán)的中央,偏向于帶正電荷,與其相聯(lián)的氮原子則偏向于帶負(fù)電荷,因而卟啉具有極性,是親水的,可以與蛋白質(zhì)結(jié)合。植醇是一個(gè)親脂的脂肪鏈,它決定了葉綠素的脂溶性。自然界中的葉綠素根據(jù)分子母環(huán)骨架和支鏈的差別可分為葉綠素a、b、c、d、f以及原葉綠素等,各種葉綠素之間的結(jié)構(gòu)差別較小[14-15]。

海藻中葉綠素和其他高等植物中分離的葉綠素化學(xué)結(jié)構(gòu)相同,為鎂卟啉化合物,從六種大型海藻中分離鑒定的葉綠素衍生物主要骨架有葉綠素a、b、c1、c2和紫紅素,基本骨架結(jié)構(gòu)見圖1。葉綠素衍生物的取代基結(jié)構(gòu)見表2。

表2 海藻中葉綠素及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Table 2 Chemical structure of chlorophyll and its derivatives in algae

圖1 海藻中葉綠素基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Basic structure of chlorophyll in algae

葉綠素很不穩(wěn)定,光、酸、堿、氧、氧化劑等都會(huì)使其分解,產(chǎn)生各種葉綠素衍生物[16]。葉綠素分子(Chlorophyll)在高溫蒸汽或微波加熱下,容易脫去酯基,生成焦葉綠素(Pyrochlorophyll);在酸性條件下,容易失去卟啉環(huán)中的鎂生成脫鎂葉綠素(Pheophytin);在堿性環(huán)境下發(fā)生水解,脫去植基,轉(zhuǎn)變?yōu)槊撝不~綠素(Chlorophyllide);脫鎂葉綠素遇堿性條件能進(jìn)一步脫去植基,生成脫鎂葉綠酸(Pheophorbide)。葉綠素分子的α-H位點(diǎn)在生理?xiàng)l件下易被羥基取代,生成羥基葉綠素的衍生物。葉綠素a衍生物在加熱條件下發(fā)生異構(gòu)化,形成葉綠素a′,而且在經(jīng)過(guò)熱燙、微波、蒸汽以及烘烤處理后,異構(gòu)體葉綠素a′達(dá)到最大值,并且葉綠素b′比葉綠素a′更容易生成[17]。

葉綠素本身呈綠色,遇酸后卟啉環(huán)中的鎂離子被氫離子置換,生成褐色的脫鎂葉綠素,這是海藻制品色澤褐變的原因。葉綠素在堿性溶液中水解生成綠色水溶性的脫植基葉綠素,這項(xiàng)化學(xué)反應(yīng)可應(yīng)用于海藻制品護(hù)色工藝,用堿處理保持海藻的色澤鮮綠。

可見,葉綠素分子中的活性位點(diǎn),如鎂原子、酯鍵以及羰基的α-H在生理代謝過(guò)程中或提取分離的理化條件下容易斷裂或失去,形成多種葉綠素的衍生物[18-19]。以葉綠素a為例,其在生理代謝或理化條件下可形成衍生物,葉綠素及衍生物的轉(zhuǎn)化如圖2。

圖2 葉綠素及衍生物結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化Fig.2 Chemical transformation of chlorophyll and its derivatives

3 葉綠素及其衍生物的生理活性

從海藻中提取分離的葉綠素類衍生物具有多種生理活性[20],可用于食品化妝品以及醫(yī)藥產(chǎn)品等領(lǐng)域。

3.1 抗氧化活性

葉綠素的抗氧化活性和結(jié)構(gòu)中的卟啉環(huán)、植基鏈以及擴(kuò)展的鍵合雙鍵有關(guān),尤其是卟啉環(huán)結(jié)構(gòu),它是葉綠素a化合物具有抗氧化活性的必要結(jié)構(gòu)[21]。Lanfer marquez等[22]制備了不同的葉綠素衍生物,并觀察其抗氧化活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉綠素b的衍生物比葉綠素a的抗氧化活性更強(qiáng),其分子結(jié)構(gòu)的醛基取代甲基后導(dǎo)致了更強(qiáng)的抗氧化活性。Cho等[23]發(fā)現(xiàn)從滸苔中提取的葉綠素a的衍生物脫鎂葉綠素a具有比海藻多酚更強(qiáng)的抗氧化活性。Cahyan等[24]從褐藻中提取焦脫鎂葉綠酸a(Pyropheophytin a),檢測(cè)出其抗氧化活性比化學(xué)合成抗氧劑維生素E和BHT(丁基羥基甲苯)更強(qiáng)。Yuan等[13]從紅藻海發(fā)菜中提取分離并鑒定了葉綠素成分,主要包括葉綠素a的衍生物羥基脫鎂葉綠酸、羥基脫鎂葉綠素、脫鎂葉綠素等化合物,并檢測(cè)其抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)從海發(fā)菜中提取的葉綠素衍生物具有清除DPPH自由基、羥基自由基的活性,表明該類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

3.2 抗炎活性

生命機(jī)體的免疫系統(tǒng)在刺激作用下會(huì)釋放多種炎癥因子,包括一氧化氮(NO)、前列腺素2(PGE2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1b(IL-1b)、活性氧(ROS)[25]。海藻中的天然色素具有抗炎活性,其中巖藻黃素的抗炎活性報(bào)道較多,葉綠素衍生物的抗炎活性報(bào)道較少。從滸苔中分離的脫鎂葉綠酸a能夠抑制12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)導(dǎo)致的超氧自由基,從而抑制小鼠巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[26-27]。脫鎂葉綠酸a(PPBa)及其衍生物羥基脫鎂葉綠酸a(HOPPBa)、銅脫鎂葉綠酸a(CuPPBa)能通過(guò)抑制炎癥應(yīng)答，達(dá)到抑制腫瘤的作用,分別用致癌誘導(dǎo)劑二甲基苯蒽(DMBA)和12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)處理ICR小鼠,建立小鼠皮膚癌模型,然后局部給藥PPBa(劑量160 nmol),治療小鼠和對(duì)照組相比,顯著降低小鼠皮膚癌的發(fā)病數(shù)和發(fā)病程度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PPBa及其衍生物抗腫瘤機(jī)制與抑制炎癥應(yīng)答降低炎癥因子超氧陰離子產(chǎn)生、抑制白介素活性有關(guān)?？墒承院衷宓募状继崛∥锞哂袕?qiáng)的抗炎活性,能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7 巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng),通過(guò)抑制iNOS(誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶)以及COX-2(環(huán)氧合酶-2)的表達(dá),抑制并清除炎性反應(yīng)中生成的炎性因子NO,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)揮抗炎活性的化學(xué)成分為兩種葉綠素衍生物脫鎂葉綠酸a和脫鎂葉綠素a[28]。

3.3 抗腫瘤活性

從紫菜和滸苔中分離純化的脫鎂葉綠素a(Pheophytin a)可用于治療鼠傷寒沙門氏菌相關(guān)的致癌作用,因其能抑制鼠傷寒中UMUC基因表達(dá),可用于開發(fā)成預(yù)防皮膚癌的化療藥物[29-30]。

脫鎂葉綠酸a可作為光動(dòng)能化療藥物及輔助藥物的報(bào)道很多。Yoon等[31]報(bào)道，脫鎂葉綠酸a可作為光動(dòng)能化療藥物,用于治療人皮膚癌。該制劑對(duì)人皮膚癌細(xì)胞A431和G361細(xì)胞株都有明顯的抑制作用,能分別激活兩種細(xì)胞的ERK1/2通路和p38蛋白,發(fā)揮其抑制腫瘤增殖的作用。在移植瘤動(dòng)物模型中,該制劑表現(xiàn)出強(qiáng)大的自我吞噬以及凋亡作用,從而達(dá)到抑制腫瘤的治療效果。Tang等[32]報(bào)道，脫鎂葉綠酸a作為光動(dòng)能用于耐藥性肝癌的治療,其機(jī)制是通過(guò)抑制p糖蛋白介導(dǎo)的耐藥性JNK激酶活性。

Chypre等[33]報(bào)道葉綠素衍生物脫鎂葉綠酸a和紫紅素-18(Purpurin 18)能束縛重組的RANKL,并抑制ELISA反應(yīng)中的 RANK-RANKL 相互反應(yīng),從而抑制模型細(xì)胞的 RANKL-依賴活性,阻止RANK-表達(dá)前體細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞。這項(xiàng)研究為卟啉環(huán)類小分子化合物作為非肽類治療劑用于靶向治療RANK and RANKL提供了思路。

3.4 抗神經(jīng)活性

脫鎂葉綠酸a是從褐藻中提取分離的一種葉綠素類衍生物,能夠用于治療神經(jīng)性疾病如阿爾茲海默癥,它能促進(jìn)PC12細(xì)胞分化。脫鎂葉綠素a及其類似物Vitamin B12衍生物能促進(jìn)PC12細(xì)胞的神經(jīng)突增生[34],其活性可能與化合物的分子量低有關(guān),低分子量的葉綠素衍生物容易并入細(xì)胞內(nèi),從而促進(jìn)神經(jīng)突增生。

3.5 抗變態(tài)反應(yīng)

Yoshioka等[35]報(bào)道，從褐藻中分離提取的葉綠素c2具有抗變態(tài)反應(yīng)。純化的葉綠素c2能夠抑制RBL-2H3細(xì)胞的脫粒作用,從而產(chǎn)生抗變態(tài)反應(yīng)效果,但葉綠素a和葉綠素b卻沒有這樣的作用。脫鎂葉綠酸a對(duì)某些人群還有導(dǎo)致過(guò)敏作用。

3.6 其他生物活性

綠藻中的葉綠素衍生物能促進(jìn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)二噁英毒素的排泄,可用于防治有機(jī)脂類化合物中毒[5]。

條斑紫菜的甲醇提取物含有大量葉綠素衍生物,研究結(jié)果表明,此提取物對(duì)赤潮微藻的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用且具有濃度依賴性,同時(shí)致使米氏凱倫藻、中肋骨條藻和塔瑪亞歷山大藻等3種赤潮微藻體積變小、運(yùn)動(dòng)能力下降、藻細(xì)胞出現(xiàn)空洞、細(xì)胞破碎和色素減褪等現(xiàn)象。赤潮微藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)和多糖含量顯著減低[36]。

4 應(yīng)用和展望

海藻資源豐富、生長(zhǎng)快速且含有大量陸地植物所缺乏的生物活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),這些特性決定了海藻具有巨大的經(jīng)濟(jì)開發(fā)價(jià)值。海藻的價(jià)值不僅體現(xiàn)在食用方面,還廣泛應(yīng)用于海洋工業(yè)原料、海洋保健藥物、化學(xué)化工、飼料肥料、污水凈化、食品加工和美容護(hù)膚等諸多方面。海藻中的葉綠素含量豐富、用途廣泛,但由于其對(duì)光、熱、酸、堿、酶等理化因素敏感,應(yīng)用受到限制。因此,用現(xiàn)代科技手段提取并純化葉綠素及其衍生物,并對(duì)其結(jié)構(gòu)加以化學(xué)修飾,制成結(jié)構(gòu)明確、性質(zhì)穩(wěn)定的葉綠素單體或混合制劑,是葉綠素類新產(chǎn)品的研究熱點(diǎn),尤其是在功能性食品、醫(yī)藥、化妝品等方面有良好的開發(fā)前景。