吳啟康,田曉靜,胡程香,王麗萍,谷小芳,桂榮娟,鄭美慧,柴春蓉

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730124)

枸杞(LyciumbarbarumL.)果實為傳統(tǒng)中藥材,其中寧夏枸杞最為盛名[1]。由于枸杞成熟果實含有枸杞多糖、多種氨基酸、微量元素、維生素、牛磺酸、生物堿、揮發(fā)油等多種生物活性物質(zhì)[2-5],其組分復(fù)雜不易進(jìn)行檢測分析。揮發(fā)油又稱精油(EssentialOils),是廣泛存在于植物體內(nèi)的芳香族化合物、脂肪族化合物和萜類化合物的總稱,主要分為萜類、烷烴、烯烴、醇類、酯類、含羥基類和羧基類物質(zhì)[6]。提取后,揮發(fā)油呈淡黃色油狀液體,常溫下可揮發(fā),有香味。揮發(fā)油具有抗炎、抗過敏、抗微生物、抗癌、酶抑制[10-15]等多種生物活性。國內(nèi)外對枸杞的研究大多是多糖、黃酮、花色苷等組分的提取,對其精油的化學(xué)組成及其抗氧化性的研究鮮見報道[7-14]。

研究揮發(fā)油的提取分離技術(shù)藥食同源的植物果實開發(fā)和利用具有重要意義,在揮發(fā)油提取的過程中,要保證組分活性不被破壞,保證質(zhì)量的前提下提高得率[15]。幾年來常見的提取方法有水蒸氣蒸餾法、有機溶劑萃取法、酶解法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法、同時蒸餾萃取法、固相微萃取法、頂空采集法等[16-19],各種方法在提取率、揮發(fā)油組成上存在一定差異。為鑒別差異,通常引用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)鑒定不同方法提取的揮發(fā)油組分及其含量。

現(xiàn)對枸杞揮發(fā)油的研究主要是對其組分的鑒定,對比不同方法提取揮發(fā)油的組分的差異,還沒有其提取工藝的優(yōu)化與不同品種和年份的差異研究。本文擬在優(yōu)選有機溶劑的基礎(chǔ)上,以料液比、浸泡時間、回流時間為因素,采用單因素實驗和正交試驗研究各因素對加熱回流法提取枸杞揮發(fā)油的影響規(guī)律,對其工藝進(jìn)行優(yōu)化,并研究不同品種和不同年份枸杞揮發(fā)油得率的差異,為枸杞品質(zhì)監(jiān)督與檢測提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

枸杞 寧夏枸杞樣品由寧夏大學(xué)康寧波老師(寧夏中寧人)在產(chǎn)地采樣。基本信息見表1。環(huán)己烷,正己烷,丙酮,甲醇,異丙醇,乙醇,乙醚,無水硫酸鈉 均為分析純,購于天津市百世化工有限公司。

表1 枸杞基本信息Table 1 Basic information of Lycium barbarum L.

101型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京科偉永興有限公司;DG120型四兩裝中藥材粉碎機 浙江省瑞安市春海藥材器械廠;FA2003N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鄭州市亞榮儀器有限公司;A-1000S型水流抽氣機 上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞揮發(fā)油提取工藝 枸杞購回后,置于-18 ℃冷凍。實驗前,將枸杞取出恢復(fù)室溫后待用;挑選出破損、變色顆粒后獲得完整枸杞顆粒,以蒸餾水清洗完整的枸杞樣品,于105 ℃烘干6 h至恒重。以中藥粉碎機將干燥枸杞粉碎后,置于4 ℃冷藏備用。

精確稱取20.00 g枸杞粉,按照一定比例加入有機溶劑浸泡一段時間,然后采用冷凝回流管水浴回流(78 ℃)一定時間,回流提取兩次,合并提取液,以少量環(huán)己烷潤洗兩次,合并潤洗液。以無水硫酸鈉除去其中水分,靜置6～8 h過夜后過濾,并以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在有機溶劑沸點溫度,蒸發(fā)30 min分離有機溶劑,獲得粗揮發(fā)油。按照公式(1)計算得油率。

式(1)

式中，X：枸杞揮發(fā)油得率,%;m：試驗提取獲得枸杞揮發(fā)油質(zhì)量,g;M：試驗采用枸杞原料質(zhì)量,g。

1.2.2 有機溶劑的篩選 依照1.2.1工藝,以料液比1∶8 (w/v,g/mL)、浸泡時間4 h、回流時間3 h,2016年寧杞1號枸杞為原料,對比正己烷、環(huán)己烷、乙醚、丙酮、異丙醇、甲醇、乙醇七種有機溶劑效率,研究有機溶劑對枸杞揮發(fā)油得率的影響規(guī)律,觀察色澤是否為黃色、是否摻雜,香氣是否純正。

1.2.3 單因素實驗設(shè)計 以2016年寧杞1號枸杞為原料,按照1.2.1中描述的試驗方法,采用單因素實驗研究料液比(w/v,g/mL)、浸泡時間(h)、回流時間(h)三個因素對枸杞揮發(fā)油得率的影響規(guī)律。

1.2.3.1 料液比對枸杞揮發(fā)油得率的影響 以環(huán)己烷為有機溶劑,浸泡4 h,回流3 h,連續(xù)回流兩次,研究料液比(w/v,g/mL)(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14)對枸杞揮發(fā)油得率的影響。

1.2.3.2 浸泡時間對枸杞揮發(fā)油得率的影響 以環(huán)己烷為有機溶劑,在料液比1∶10 (w/v,g/mL),回流3 h,連續(xù)回流兩次,研究浸泡時間(1、2、3、4、5 h)對枸杞揮發(fā)油得率的影響。

1.2.3.3 回流時間對枸杞揮發(fā)油得率的影響 以環(huán)己烷為有機溶劑,在料液比為1∶10 (w/v,g/mL),浸泡4 h,連續(xù)回流兩次,研究回流時間(1、2、3、4、5 h)對枸杞揮發(fā)油得率的影響。

1.2.4 正交試驗設(shè)計 為優(yōu)化枸杞揮發(fā)油的提取工藝,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以2016年寧杞1號枸杞為原料,以枸杞揮發(fā)油得率為指標(biāo),以料液比、浸泡時間、回流時間為影響因素,采用L9(34)進(jìn)行3因素3水平正交試驗,其因素水平設(shè)計見表2。

表2 加熱回流法正交試驗因素水平表Table 2 Orthogonal test factor level table for heating reflux method

1.2.5 不同品種、年份枸杞揮發(fā)油得率的比較 采用枸杞揮發(fā)油提取工藝的優(yōu)化后的方法提取表1中不同品種和不同年份的枸杞揮發(fā)油,并對比各揮發(fā)油得率的差異。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin軟件進(jìn)行單因素實驗結(jié)果的繪圖。SPSS軟件進(jìn)行正交試驗設(shè)計,不同品種、年份的枸杞揮發(fā)油得率的差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機溶劑的選取

所選七種有機提取劑對枸杞揮發(fā)油得率的影響結(jié)果見表3。醇類有機溶劑提取的揮發(fā)油得率較大(6.82%～31.13%),但揮發(fā)油色澤性質(zhì)不佳,含有大量的雜質(zhì),且具有很濃的焦糖味;乙醚(2.83%)和丙酮(2.68%)得率較低,因乙醚具有毒性,不適宜作為提取劑;正己烷(2.97%)與環(huán)己烷(3.13%)比較,環(huán)己烷得率高且最穩(wěn)定,且揮發(fā)油極性小,故不宜采用乙醚、丙酮、異丙醇、甲醇、乙醇這些極性較大的溶劑提取。綜合分析,采用環(huán)己烷為枸杞揮發(fā)油提取的有機溶劑。

表3 不同有機溶劑對得率的影響Table 3 Influence of different organic solvents on extraction rate

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 料液比對得率的影響 根據(jù)圖1所示,由于枸杞揮發(fā)油極性小,使用有機溶劑環(huán)己烷浸泡提取枸杞揮發(fā)油可以有效的溶解出來,在一定的使用范圍內(nèi),枸杞揮發(fā)油的得率隨著環(huán)己烷使用量的增加而增加,當(dāng)料液比超過1∶10 (w/v,g/mL)時(3.15%),得率會有所下降,枸杞在浸泡過程中溶解度降低[20],因此,適宜料液比選擇1∶10 (w/v,g/mL)。

圖1 料液比對枸杞揮發(fā)油得率的影響Fig.1 The effect of the ratio of material to liquid on the yield of volatile oil from Lycium barbarum L.

2.2.2 浸泡時間對得率的影響 結(jié)果如圖2所示,在環(huán)己烷浸泡時,枸杞揮發(fā)油不斷的溶解析出,浸泡4 h之后,枸杞揮發(fā)油的溶解達(dá)到最高(3.15%),在枸杞揮發(fā)油溶解析出的過程中,有少量的揮發(fā)油組分會與環(huán)己烷發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[21],造成損失。因此確定較佳浸泡時間為4 h。

圖2 浸泡時間對枸杞揮發(fā)油得率的影響Fig.2 The effect of immerse time on the yield of volatile oil from Lycium barbarum L.

2.2.3 回流時間對得率的影響 結(jié)果如圖3所示,環(huán)己烷與枸杞揮發(fā)油在加熱情況下分子運動加劇,分子之間接觸的可能性變大,從而增強了揮發(fā)油的得率,隨著回流時間的增加,枸杞揮發(fā)油的得率不斷增加,回流3 h后得率達(dá)到最高(3.12%),3 h后,由于長時間的加熱處理,少量揮發(fā)油揮發(fā)、分解、氧化[22],造成得率隨著下降。所以最適的環(huán)己烷加熱回流時間為3 h。

圖3 回流時間對枸杞揮發(fā)油得率的影響Fig.3 The effect of reflux time on the yield of volatile oil from Lycium barbarum L.

2.3 正交試驗結(jié)果

極差分析(表4)發(fā)現(xiàn),各因素對枸杞揮發(fā)油提取影響順序依次為回流時間>浸泡時間>料液比,最佳提取條件為A1B2C3,即料液比1∶8 (w/v,g/mL)、浸泡時間4 h、回流時間4 h。在此條件下進(jìn)行驗證實驗,提取5次,得率為3.68%±0.13%。

表4 枸杞揮發(fā)油提取正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results for solvent extraction method

2.4 不同品種、年份枸杞揮發(fā)油得率差異研究

在優(yōu)化條件下,分別對不同品種和不同年份的枸杞揮發(fā)油進(jìn)行提取,結(jié)果如表6所示。

表6 不同條件枸杞揮發(fā)性油得率數(shù)據(jù)分析Table 6 Analysis of volatile oil content of Lycium barbarum L. under different conditions

2016年寧杞1號、寧杞5號、小顆粒果的枸杞揮發(fā)油得率具有差異顯著(p<0.05),小顆粒枸杞的揮發(fā)油得率最高;青海西寧、甘肅瓜州和河北枸杞無差異,證明品種對枸杞揮發(fā)油的得率具有一定的影響。在不同的地域因為氣候條件、空氣濕度、土壤組成組分等多種條件的不同而產(chǎn)生差異[23]。同時結(jié)果顯示,不同生產(chǎn)年份的枸杞揮油的得率具有顯著的差異(p<0.05),2016年寧夏1號枸杞揮發(fā)油得率最高。有可能因為枸杞在采后的貯藏運輸中造成揮發(fā)油的揮發(fā)或者因為儲藏條件不適宜造成揮發(fā)油組分受到破壞。

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化獲得較佳的提取條件為A1B2C3,即料液比1∶8 (w/v,g/mL)、浸泡時間4 h、回流時間4 h;在該條件下枸杞揮發(fā)油得率為3.68%±0.13%。在最優(yōu)條件下提取發(fā)現(xiàn)小顆粒果枸杞揮發(fā)油得率顯著高于其他品種枸杞,新鮮枸杞揮發(fā)油得率顯著高于陳舊的枸杞,枸杞揮發(fā)油得率在不同品種和不同年份上具有一定的差異性。對不同品種枸杞子,寧夏產(chǎn)三個品種枸杞之間揮發(fā)油得率差異顯著(p<0.05),且均顯著高于其他品種枸杞;河北與青海和甘肅枸杞中揮發(fā)油得率差異不顯著。對不同年份產(chǎn)寧夏枸杞,貯藏時間對枸杞揮發(fā)油得率影響顯著(p<0.05),揮發(fā)油會貯藏時間延長,得率逐漸下降。上述結(jié)果為枸杞揮發(fā)油的提取和深加工奠定基礎(chǔ),同時可通過枸杞檢測枸杞揮發(fā)油的得率,簡單判定枸杞的品種和生產(chǎn)時間,為市場監(jiān)督枸杞品質(zhì)提供理論依據(jù)。