陸偉桃

廣州市黃埔區(qū)紅十字會醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510760

肺結核是臨床常見、多發(fā)的傳染性疾病，以往臨床主要依據痰涂片檢測結果判斷病情，但由于此法易受到外界因素干擾，因此高達50% ～ 70%活動性肺結核患者經其檢測結果為陰性[1]。近年來隨著臨床醫(yī)學水平不斷提高，痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法（tubercle bacillus-phage amplified biologically assay， TB-PhaB）、痰結核菌脫氧核糖核 酸（tubercle bacillus-deoxyribonucleic acid，TBDNA）檢測法已廣泛應用于肺結核診斷、治療過程中并取得顯著效果，但二者聯(lián)合診斷痰菌陰性肺結核研究資料尚少[2]。本文將選取我院于2015年2月～ 2017年9月期間收治的93例痰菌陰性肺結核患者作為本次研究對象，探討痰結核分枝桿菌噬菌體生物擴增法（TB-PhaB）、痰結核菌脫氧核糖核酸（TB-DNA）聯(lián)合檢測對診斷痰菌陰性肺結核的臨床應用價值，為提高此病臨床檢出率提供可靠依據，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院于2015年2月～2017年9月期間收治的93例肺結核患者均經痰結核菌檢查結果為陰性，其中男59例，女34例，年齡18～81歲，平均（43.2±1.7）歲，病程2～12年，平均（5.02±0.34）年，臨床類型：初治失敗40例、初治成功后復發(fā)53例。納入與排除標準：（1）符合《肺結核診斷和指南》（由中華醫(yī)學會結核病學會制定）中關于“菌陰性肺結核診斷”相關標準[3]；（2）經痰涂片（3次）、痰培養(yǎng)（1次）檢查結果為陰性；（3）影像學檢查可見活動性肺結核征象（X線、CT等）；（4）表現(xiàn)為乏力、咳嗽等肺結核相關癥狀；（5）排除合并其他呼吸系統(tǒng)疾病者；（6）排除妊娠、產褥、哺乳等特殊生理時期女性菌陰性肺結核患者；（7）排除合并惡性腫瘤以及精神、免疫、血液等系統(tǒng)疾病者；（8）排除合并其他感染性疾病者；（9）對本次研究所需痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法、痰結核菌脫氧核糖核酸檢測法均具有良好耐受性、無相關禁忌癥；（10）于本次研究前未接受任何抗結核治療；（11）患者對本次研究內容具有知情權，于研究前指導其獨立簽署知情同意書（該協(xié)議由本院倫理研究會制定），本文研究內容通過本院倫理研究會審核。

1.2 方法

1.2.1 研究方法 93例痰菌陰性肺結核患者均接受痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法、痰結核菌脫氧核糖核酸檢測法實驗室檢查，指定高年資、?？茖嶒炇夜ぷ魅藛T完成相關操作。記錄93例痰菌陰性肺結核患者上述二者聯(lián)合檢查診斷結果，以兩種方法均符合陽性即判斷為該患者陽性，反之則為陰性，將聯(lián)合檢查結果、病理診斷結果行統(tǒng)計學分析（SPSS軟件）后得出結論。

1.2.2 檢查方法

1.2.2.1 痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法 痰液經N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉液化后利用液體培養(yǎng)基離心洗滌（2次），取沉淀加入液體培養(yǎng)基（1mL）經37℃條件下行24h溫育，之后加入分枝桿菌噬菌體100μL混勻并繼續(xù)行1h溫育（條件同上）。溫育結束后加入殺菌劑（100μL）并充分混勻，于室溫下放置5min后加入液體培養(yǎng)基（5mL）并混勻，加入指示細胞1mL混勻，將上述操作完成后所得溶液澆注平皿（55℃、5mL瓊脂）并旋轉混勻，待靜置成型后培養(yǎng)18～24h（37℃條件下）。待培養(yǎng)結束后根據培養(yǎng)皿中菌斑情況判斷病情，即0～1個菌斑為陰性、2個及以上菌斑為陽性。

1.2.2.2 痰結核菌脫氧核糖核酸檢測法 利用廣州達安臨床檢驗中心有限公司提供的檢測系統(tǒng)（型號：DA-7600）及配套結核分支桿菌核酸檢驗試劑盒經實時免疫熒光定量聚合酶鏈反應（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）完成痰結核菌脫氧核糖核酸檢測。取1.0～1.5mL氫氧化鈉加入試管中搖勻，于室溫下放置液化痰液（15～30min），待液化完成后給予5min離心（每分鐘12000轉）。取沉淀加入1mL無菌生理鹽水后混勻（振蕩）并再次離心5min（轉速與前次相同），所得沉渣加入50μmDNA提取液并混勻，于100℃條件下恒溫處理10min，之后將其放置于4℃環(huán)境下冷卻至室溫并離心5min（轉速與前次相同）。取2μm上清液加入PCR反應管中給予數秒離心（每分鐘轉速8000轉），離心完成后將PCR反應管放入PCR儀中擴增處理，預變性參數設置為2min、93℃，完成后于93℃、45s至55℃、60s行10個循環(huán)，93℃、45s至55℃、120s行30個循環(huán)。待上述操作完成后經熒光檢測并記錄讀數，以50拷貝作為敏感度下限。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS19.0版對數據進行統(tǒng)計分析，研究所得兩組痰菌陰性肺結核患者痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法聯(lián)合痰結核菌脫氧核糖核酸檢測法檢測結果、病理診斷結果均屬于計數資料，以百分數（%）表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 檢測結果分析

93例痰菌陰性肺結核患者均順利完成痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法、痰結核菌脫氧核糖核酸檢測法檢測（檢查完成率均為100.00%），經分析可知，痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法聯(lián)合痰結核菌脫氧核糖核酸檢測對疾病確診率高達94.62%，此數據與病理診斷（100.00%）結果比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.29，P ＞0.05）。見表1。

表1 93例痰菌陰性肺結核患者痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法聯(lián)合痰結核菌脫氧核糖核酸檢測、病理診斷結果比較分析[n（%）]

2.2 敏感性

經分析可知，痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法聯(lián)合痰結核菌脫氧核糖核酸檢測對肺結核的診斷敏感性為94.62%。注：敏感度=[88/（88+5）]×100.00%。

3 討論

結核分枝桿菌（M.tuberculosis）感染是引起結核病的主要原因，由于其傳播途徑多為呼吸道，因此目前臨床多見為肺結核患者。但有研究顯示[4]，肺結核發(fā)病后可累及機體多個重要器官甚至危及患者生命安全，因此及時確診、正確治療是保障患者療效、預后的關鍵。雖然在各級黨政機關大力支持下我國肺結核發(fā)病率較之前有所降低，但由于近年來人們生活習慣、節(jié)奏、環(huán)境等因素不斷變化，部分地區(qū)肺結核發(fā)病率呈小幅提高，因此如何采取有效措施盡快確診病情、使患者及時獲得臨床對癥干預控制病情，仍是廣大臨床醫(yī)護人員共同關注的熱點。

研究表明[5]，相較于其他呼吸系統(tǒng)疾病而言，肺結核發(fā)病后并無典型臨床表現(xiàn)，因此將對臨床診治工作造成一定困難，雖然目前影像學技術已獲得快速發(fā)展，CT、X線片等手段對肺結核的診斷均具有重要價值，但肺結核病灶復雜多樣，因此僅依靠影像學檢查結果并無法明確病情，提示此法僅可作為輔助檢查手段[6]。研究表明，由于結核桿菌是此病傳染源，因此臨床仍需依靠實驗室檢驗結果確診病情[6]。痰培養(yǎng)是以往臨床用于確診肺結核病情的主要方法，但此法所需時間長，且并不適用所有類型肺結核疾病，因此其仍具有一定漏診率。目前有相關資料統(tǒng)計可知[7]，60% ～ 70%肺結核患者經痰培養(yǎng)呈陰性，而隨訪（1～3年）后痰菌陰性肺結核患者中40%～60%將逐漸轉陽，應引起相關醫(yī)護人員高度重視。

痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法是近年來于臨床推廣的肺結核診斷方法，因其操作過程中對設備要求低、學習曲線短等特點，尤其適用于各級基層醫(yī)療機構行相關檢查[8]。痰結核分枝桿菌噬菌體生物擴增法檢查機理：分支桿菌噬菌體可對活的分支桿菌產生感染，因此提示未進入感染菌體的噬菌體將被相應殺毒劑滅活，而已經進入菌體內的噬菌體則無法受到影響，感染菌體內噬菌體將表現(xiàn)出大量增殖狀態(tài)并裂解感染菌體，此過程中將有子代噬菌體釋放并對隨后加入的指示細胞產生感染、裂解等作用，因此可見透亮噬菌斑存在于瓊脂平板上，根據其有無、數量等情況即可對所檢標本中結核分支桿菌、非結核分枝桿菌給予準確判斷。但有研究顯示[9]，痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法對肺結核診斷所需時間長（24～48h），且檢測過程中噬菌濃度、痰標本預處理、殺毒及滅火條件指示細胞、感染時間等外界因素均將對結果造成一定影響，因此易貽誤病情治療時機、假陽性及假陰性率均較高，應引起相關醫(yī)護人員注意。

痰結核菌脫氧核糖核酸檢測法將核酸擴增、光譜、雜交等技術有效結合，于封閉條件下完成相關操作，從而有效避免因擴增產物污染所致假陽性情況，此外該方法通過結合自動分析技術使臨床實驗室檢驗方法具有特異、精準、快速、簡便等特點[10]。但有研究顯示[11]，由于痰結核菌脫氧核糖核酸檢測法操作步驟多，檢測結果多依賴于質控品、試劑及儀器情況，因此仍將存在少數假陽性、假陰性幾率?；诖?，有學者[12]認為若將痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法聯(lián)合痰結核菌脫氧核糖核酸檢測用于診斷肺結核病情，將使二者特點結合起到相輔相成作用，從而有利于臨床獲得更為準確的痰菌陰性肺結核檢出率。本文對93例痰菌陰性肺結核患者臨床資料分析可知，其接受痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法、痰結核菌脫氧核糖核酸檢測完成率為100.00%，二者聯(lián)合診斷疾病陽性率高達94.62%，痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法聯(lián)合痰結核菌脫氧核糖核酸檢測對肺結核的診斷敏感性為94.62%，此結論與國內外相關研究結果相符[13-15]。但有研究顯示[16]，痰結核菌脫氧核糖核酸檢測法需經專業(yè)機構認證的檢驗人員及相關環(huán)境（實驗室）方可完成肺結核檢驗，因此對醫(yī)療機構資質、設備、人員等條件均具有較高要求，提示此法并不適用于基層醫(yī)療機構推廣，此問題需在今后實際工作中加以深入研究并提出解決方案。

綜上，應用痰結核分支桿菌噬菌體生物擴增法、痰結核菌脫氧核糖核酸檢測法聯(lián)合診斷肺結核具有較為理想的臨床檢出率，有利于盡快確診患者病情并提供對癥救治，對保障其生活質量、生命安全均具有積極意義，值得今后推廣。