包怡紅 劉文麗

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

Ultrasonic-assisted salting-out hydrodistillation extraction method was used to extract essential oil of Pinus tabulaeformis needles. By using single factor experiment, the extraction conditions of P. tabulaeformis needles oil were optimized by orthogonal method. Combined with the disc diffusion method and microatmosphere test the antibacterial activity of essential oil of P. tabulaeformis needles were determined. Double dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC). The effects of pH, temperature and ultraviolet on the antibacterial effect of essential oil of P. tabulaeformis needles were studied. The optimum extraction conditions of essential oil of P. tabulaeformis needles are ultrasonic power of 240 W, ultrasonic time of 60 min, NaCl of 4%, and extraction time of 5 h. Three times of verification experiments show that the yield of P. tabulaeformis needles oil is 0.388 2%. P. tabulaeformis needles oil has inhibitory effects on all three strains of bacteria, and has little antibacterial effect on Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus oryzae. MICs of essential oil to Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and Escherichia coli are 5, 10 and 20 μL/mL, respectively. The essential oils has good stability to temperature and ultraviolet radiation, and their antibacterial activity was unstable under different pH conditions. Antibacterial activity was strong in acid and weak in base solution.

黑皮油松(Pinustabulaeformis)為松科(Pinaceae)松屬(Pinus)植物，其葉為松針，常被用于醫(yī)藥以及食品添加劑領(lǐng)域，具有活血安神、消炎止癢之功效[1]，主要分布在中國東北地區(qū)。經(jīng)查閱文獻，對松針的研究集中在化學(xué)成分[2]、黃酮提取[3]、藥理[4]、莽草酸提取及腫瘤治療[5]等幾個方面，而在松針精油提取和抑菌活性方面的研究報道很少。王得道[2]運用了水蒸氣蒸餾法提取黑皮油松松針精油，并且測得了主要成分是烯烴類和芳香類，其中石竹烯含量最高。超聲波輔助處理可以產(chǎn)生空化效應(yīng)和機械剪切效應(yīng)，加快分子的運動，使萃取成分與溶劑充分混合，有助于內(nèi)容物的溶出[6-7]。鹽析效應(yīng)是為了強化有機物的分離效果，在水蒸氣蒸餾中加入某種無機鹽，在含水體系中，鹽可以通過親和力“氫鍵”離子的靜電等作用與溶液中某種組分發(fā)生優(yōu)先溶劑化反應(yīng)，形成難揮發(fā)的化合物，從而減少了該組分與另一組分之間的吸引作用[8]。

植物精油具有良好的抑菌抗炎活性[9]，由于現(xiàn)有的化學(xué)抑菌劑副作用較大，精油作為天然成分更適合用于食品的保鮮防腐。本試驗采用超聲波鹽析輔助的方法提取黑皮油松松針中的精油，且以精油得率為指標，采用L9(34)正交表進行實驗，進行最佳工藝條件的確定，并對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等微生物的抑制作用進行了研究，此外，還探討了熱處理、pH值和紫外線照射條件對精油抑菌穩(wěn)定性的影響，對開發(fā)天然食品防腐劑及保鮮劑具有重大的意義，為黑皮油松松針精油的開發(fā)應(yīng)用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑皮油松松針采于東北林業(yè)大學(xué)校園，將其晾干后用萬能粉碎機打碎；NaCl固體購于天津基準化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏、蛋白胨、營養(yǎng)瓊脂購于北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；吐溫-80購于天津市光復(fù)精細化工研究所提供；葡萄糖購于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、金黃色葡萄球菌(S.auTeus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、米曲霉(Aspergillus)，所有供試菌種均來源于東北林業(yè)大學(xué)微生物實驗室。

水蒸氣蒸餾裝置實驗室自備；電子天平購于常熟市天量儀器有限責任公司；高速多功能粉碎機購于上海市頂帥工貿(mào)有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器購于昆山市超聲儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋購于上海博訊實業(yè)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購于天津市泰斯特儀器有限公司；恒溫水浴鍋購于上海一恒科技有限公司。

1.2 試驗方法

黑皮油松松針精油的提?。悍Q取50 g粉碎后的黑皮油松松針置于圓底燒瓶中，加入一定質(zhì)量分數(shù)的NaCl溶液在不同的超聲功率下處理一定的時間，回流后收集稱其質(zhì)量，重復(fù)3次，精油提取率按(1)式計算。

(1)

式中：E為精油得率(%)；m1為精油質(zhì)量(g)；m2為松針質(zhì)量(g)。

超聲功率的影響：稱量粉碎后的黑皮油松松針粉50 g，NaCl質(zhì)量分數(shù)為2%的條件下，分別在180、210、240、270、300 W超聲功率下處理30 min，水蒸氣蒸餾3 h后，計算得率。

超聲時間的影響：稱量粉碎后的黑皮油松松針粉50 g，NaCl質(zhì)量分數(shù)為2%，超聲功率為270 W的條件下，分別處理15、30、45、60、75 min，水蒸氣蒸餾3 h后，計算得率。

NaCl質(zhì)量分數(shù)的影響：稱量粉碎后的黑皮油松松針粉50 g，超聲功率為270 W的條件下,NaCl質(zhì)量分數(shù)分別為2%、4%、6%、8%、10%，超聲處理30 min，水蒸氣蒸餾3 h后，計算得率。

蒸餾時間的影響：稱量粉碎后的黑皮油松松針粉50 g，NaCl質(zhì)量分數(shù)為2%，超聲功率為270 W的條件下，分別進行水蒸氣蒸餾1、2、3、4、5 h后，計算得率。

正交試驗：在單因素的基礎(chǔ)上設(shè)計超聲功率、超聲時間、NaCl質(zhì)量分數(shù)和蒸餾時間4因素的L9(34)正交實驗，確定黑皮油松松針精油最佳提取工藝條件。

1.3 精油抑菌試驗

菌懸液的制備：取活化之后的菌體于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，細菌于37 ℃中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用平板計數(shù)法將菌懸液調(diào)整濃度為每毫升106～107個菌落群，真菌于28 ℃中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，并用血球計數(shù)法調(diào)整菌的濃度至每毫升106～107個菌落群，備用[10]。

黑皮油松松針精油的制備：將精油溶于滅菌后的吐溫-80溶液中制備成體積分數(shù)為10%的精油溶液，置于4 ℃中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

黑皮油松松針精油液相抑菌活性的測定：根據(jù)文獻[11]，測定黑皮油松松針精油對5種供試菌的抑菌活性。在無菌條件下，將培養(yǎng)基倒入滅過菌的平板后冷卻凝固，取100 μL菌懸液于培養(yǎng)基上并涂布均勻，取4片滅好菌的濾紙片(直徑為6 mm)放置于含菌平板上，其中3片滴加10 μL體積分數(shù)為10%的精油溶液，另外1片以10 μL吐溫-80溶液作為對照，細菌放置于37 ℃中培養(yǎng)24 h，真菌放置于28 ℃中培養(yǎng)48 h。多次試驗后用交叉法測得抑菌圈的直徑大小。

最低抑菌體積分數(shù)測定：根據(jù)文獻[12]，取4 mL液體培養(yǎng)基加入滅完菌的試管中，再加入1 mL用吐溫-80溶液倍比稀釋過的黑皮油松松針精油溶液，使得精油的體積分數(shù)為0.625～40 mL/L，以1 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的吐溫-80溶液作為對照，每支試管中加入菌懸液100 μL，振蕩搖勻后將其置于37 ℃中恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。從各試管中分別取100 μL于平板上并涂布均勻，放于37 ℃培養(yǎng)24 h。

黑皮油松松針精油氣相抑菌活性的測定：根據(jù)文獻[13]，取100 μL菌液于培養(yǎng)基上并涂布均勻，取一片直徑大小為25 mm的濾紙片置于培養(yǎng)皿蓋中央，向濾紙片中滴加50 μL的純精油，以50 μL無菌水作為對照，將培養(yǎng)皿密封置于37 ℃中培養(yǎng)24 h。

溫度對黑皮油松松針精油抑菌效果的影響：將體積分數(shù)10%的精油置于20、40、60、80、100 ℃處理15 min，空白組不進行處理，進行抑菌試驗。

pH值對黑皮油松松針精油抑菌效果的影響：用質(zhì)量分數(shù)2%的NaOH溶液和體積分數(shù)50%的檸檬酸將質(zhì)量分數(shù)0.1%吐溫-80的pH值分別調(diào)為4、5、6、7、8、9、10，再將精油稀釋至體積分數(shù)10%，空白組不進行處理，同時設(shè)置不同pH值的吐溫-80溶液為對照組，進行抑菌試驗。

紫外線對黑皮油松松針精油抑菌效果的影響：將體積分數(shù)為10%的精油分別在紫外燈(功率為20 W，垂直距離35 cm)下處理10、20、30、40、50、60 min，空白組不進行處理，進行抑菌試驗。

數(shù)據(jù)分析：實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，所有數(shù)據(jù)利用Word2016、Excel2016、SPSS 22.0、Origin 8.0統(tǒng)計和繪圖，進行數(shù)據(jù)方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對黑皮油松松針精油提取率的影響

超聲功率對黑皮油松松針精油得率的影響：由表1可知，隨著超聲功率的改變，精油得率先上升后下降。其原因可能是超聲功率增大導(dǎo)致空化作用也逐漸增強，加速了細胞的破碎速度，使得精油有效成分加快滲出，精油得率提高；但當超聲功率過大時則空化效應(yīng)增強的幅度過大，使得精油更多得損失于水介質(zhì)中。

表1 超聲功率對精油得率的影響

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

超聲時間對黑皮油松松針精油得率的影響：由表2可知，隨著超聲時間的增加，精油的得率也相對增加，當超聲時間到達45 min時，黑皮油松的得率基本趨于穩(wěn)定并且有所下降。這與李敏杰等[14]使用超聲波輔助提取葛縷子精油的結(jié)果一致，這可能是因為隨著超聲時間的增加，細胞的破碎程度增加，有助于精油進入溶劑中，隨著時間的增長，超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)加速升高溫度，使得精油中易揮發(fā)氧化的物質(zhì)損失，因此精油得率開始下降。

表2 超聲時間對精油得率的影響

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

NaCl質(zhì)量分數(shù)對黑皮油松松針精油得率的影響：由表3可知，精油的得率隨著NaCl質(zhì)量分數(shù)的增加也相對增加，但是當NaCl質(zhì)量分數(shù)超過4%，精油得率就開始減少。這與閆旭宇等[15]鹽析輔助提取靈香草精油結(jié)果一致，精油得率隨著NaCl質(zhì)量分數(shù)的增加而增加，超過4%時，精油得率開始下降。這可能是由于加入無機鹽可增大細胞內(nèi)外的滲透壓，更易于精油的溶出，NaCl質(zhì)量分數(shù)過高時精油提取率下降主要是因為鹽濃度升高，水蒸汽沸點升高而蒸餾溫度升高，導(dǎo)致精油損失增加[16]。

蒸餾時間對黑皮油松松針精油得率的影響：由表4可知，當蒸餾時間從1 h到4 h時，隨著時間的增長，精油的得率不斷升高，當?shù)竭_4 h之后精油得率趨于平穩(wěn)并且開始有所下降，原因是隨著時間的增長，精油中不穩(wěn)定的成分發(fā)生損失，使得精油得率下降。

表3 NaCl質(zhì)量分數(shù)對精油得率的影響

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

表4 蒸餾時間對精油得率的影響

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2 超聲波鹽析輔助提取黑皮油松松針精油的條件優(yōu)化

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，以超聲功率、超聲時間、NaCl質(zhì)量分數(shù)、蒸餾時間為影響因素，以提取率為考察指標，進行L9(34)正交試驗，因素水平見表5。

9組正交試驗獲得的精油得率分別為0.293 2%、0.321 8%、0.337 4%、0.385 9%、0.359 7%、0.368 9%、0.352 6%、0.366 1%、0.382 6%。由各因素極差R的大小可知，RA>RC>RB>RD，影響得率的因素由大到小是超聲功率、NaCl質(zhì)量分數(shù)、超聲時間、蒸餾時間，超聲功率為主要影響因素，蒸餾時間為不重要因素。由k值可得，最佳水平為A2B3C2D3，即超聲功率為240 W，超聲時間為60 min，NaCl質(zhì)量分數(shù)為4%，蒸餾時間為5 h，在此條件下進行驗證試驗，設(shè)置3組平行試驗，最終得到黑皮油松松針精油得率為0.388 2%(n=3)。本試驗優(yōu)化提取的黑皮油松松針精油得率高于王得道[2]研究的得率0.254%，這說明超聲波和鹽析輔助有助于精油得率的提高。

表5 正交試驗因素水平

2.3 黑皮油松松針精油抑菌活性

黑皮油松松針精油的液相抑菌活性：黑皮油松松針精油對5種微生物的液相抑制作用結(jié)果見表6，對3種細菌均表現(xiàn)出抑菌效果，對枯草芽孢桿菌的抑制作用最強，對金黃色葡萄球菌的抑制作用居中，抑制作用最弱的為大腸桿菌，這可能是由于革蘭氏陰性菌的細胞壁較革蘭氏陽性菌的細胞壁更為復(fù)雜，能夠阻止精油的抑菌成分進入細胞中，起到保護的作用；對釀酒酵母和米曲霉的抑菌效果較差，幾乎沒有檢測到抑菌圈。

表6 黑皮油松松針精油的液相抑菌生物活性測定結(jié)果

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；“—”表示無抑菌效果。

黑皮油松松針精油的最低抑菌體積分數(shù)：由于抑菌圈試驗表明黑皮油松松針精油對酵母菌和米曲霉抑菌效果不明顯，因此選取了對精油較敏感的3種細菌進行了最低抑菌濃度的測定，后面試驗均以這3種菌作為研究對象。

由表7可以看出，黑皮油松松針精油對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌最低抑菌體積分數(shù)分別是5、10、20 mL/L，可見精油對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好。

表7 黑皮油松松針精油對供試菌的最低抑菌體積分數(shù)

黑皮油松松針精油的氣相抑菌活性：結(jié)果見表8，黑皮油松松針精油對3種供試菌均具有抑菌效果，對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，枯草芽孢桿菌次之，作用最弱的為大腸桿菌。對革蘭氏陽性菌作用比革蘭氏陰性菌強，但抑制金黃色葡萄球菌的作用強于枯草芽孢桿菌。這種差異可能是由于液相抑菌法是直接接觸測定法，其主要取決于擴散性和溶解度，而氣相抑菌則主要依賴于精油化合物的揮發(fā)性[17]。

表8 黑皮油松松針精油的氣相抑菌生物活性測定結(jié)果

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；“—”表示無抑菌效果。

溫度對黑皮油松松針精油抑菌活性的影響：由表9可見，在20，40，60，80，100 ℃下處理后，與對照組相比，黑皮油松松針精油的抑菌活性基本維持穩(wěn)定。這與王步江等[18]人的研究結(jié)果一致。這表明加熱并沒有使精油中的抑菌成分發(fā)生改變，黑皮油松松針精油的有效成分對溫度的耐受性較好。

表9 溫度對黑皮油松精油抑菌活性的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

酸堿環(huán)境對黑皮油松松針精油抑菌活性的影響：由表10可見，pH值的改變會影響黑皮油松松針精油對細菌的抑制作用。在pH值<8時，隨著pH值的降低，抑菌圈增大，在pH值>8時，隨著pH值的增大，抑菌圈稍有增大。對照組在強酸和強堿時表現(xiàn)出對細菌的抑制作用。這與劉玉民等[19]人的試驗結(jié)果一致。精油在低pH條件下抑菌活性增強是由于在酸性條件下細菌自身的生理活性降低，同時精油的活性成分的結(jié)構(gòu)形式也發(fā)生改變，即pH值的降低能夠使精油中酚類化合物上所帶羥基的電離度降低，疏水性增強，更易于與細菌的細胞膜和脂蛋白相結(jié)合，從而提高抑菌活性[20]。pH值>8時，細菌在堿性條件下不易于生長導(dǎo)致抑菌能力的增強。因此，在酸性條件下精油的具有更好的抑菌作用。

表10 pH值對黑皮油松松針精油抑菌活性的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

紫外線照射對黑皮油松松針精油的抑菌活性的影響：由表11可見，紫外線分別照射10，20，30，40，50，60 min之后，與對照組相比，黑皮油松松針精油的抑菌活性并未發(fā)生顯著的變化。這與李婭男等[21]人研究的紫外線對4種精油穩(wěn)定性的影響的結(jié)果一致。這表明黑皮油松松針精油對紫外線具有較高的穩(wěn)定性，紫外線對精油的成分及其結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生影響。

表11 紫外線對黑皮油松松針精油抑菌活性的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

3 結(jié)論

黑皮油松松針精油的最優(yōu)提取條件是:超聲功率240 W，超聲時間60 min，NaCl質(zhì)量分數(shù)4%，蒸餾時間5 h，選用50 g粉碎完成的黑皮油松松針，按照試驗得出的條件，重復(fù)3次試驗得出精油平均得率為0.388 2%。

黑皮油松松針精油抑菌活性試驗得出，黑皮油松精油在液相和氣相方面均表現(xiàn)出對細菌較好的抑制作用，且對革蘭氏陽性菌的抑制作用強于革蘭氏陰性菌，對釀酒酵母和米曲霉的抑菌效果不明顯。

黑皮油松松針精油對溫度和紫外線的耐受性較好，這種較好的穩(wěn)定性有利于精油的開發(fā)利用。而pH值對其的抑菌效果產(chǎn)生了影響，在pH值較小的環(huán)境中抑菌效果較好，隨著pH值的增大效果減弱，因此在酸性食品的加工中有很好的應(yīng)用前景。