*

(1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾 8433003)(2 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾 8433003)

牛乳頭瘤病是由牛乳頭瘤病毒(Bovine papillomavirus，BPV)引起的一種腫瘤性疾病[1]。臨床上主要表現(xiàn)為患病處有突出體表外的乳頭狀贅生瘤體，多以1歲左右牛感染發(fā)病且表現(xiàn)明顯。在牛乳頭瘤病毒基因型中，BPV-Ⅰ型和BPV-Ⅱ型可跨種間傳播，給動(dòng)物健康造成影響[2,3]。

因乳頭瘤病毒基因型多達(dá)13種以上，而臨床診斷、病理學(xué)檢查只能作出初步判斷，且無(wú)法鑒定病毒基因類型。本研究在臨床診斷、組織病理學(xué)觀察基礎(chǔ)上，以乳頭狀瘤病毒衣殼蛋白L1基因的通用引物MY11/MY09[4]對(duì)采集的疑似乳頭瘤病料樣本進(jìn)行基因分型鑒定。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品的采集

本研究所采集病料來(lái)源于新疆南疆某養(yǎng)殖戶患病牛，經(jīng)臨床診斷初步確診后以手術(shù)方式收集體表贅生瘤樣品，一份保存于10%甲醛溶液中，另一份置于50%的甘油磷酸緩沖液并-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

D2000 Marker、2×Tap PCR Master Mix、T載體連接試劑盒、普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提取試劑盒、6×loading Buffer、溴化乙錠(EB)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；組織DNA提取試劑盒E.Z.N.A.Tissue DNA Kit購(gòu)自O(shè)mega公司；瓊脂糖(西班牙Biowest)、LB培養(yǎng)基(固、液)、氨芐青霉素購(gòu)自寶信生物技術(shù)有限公司；其余耗材和試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口的分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病理組織學(xué)觀察

取10%甲醛固定的體表贅生瘤，經(jīng)修塊處理后，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、脫蠟、H.E.染色、脫水、透明、封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察[5]。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

選取通用引物MY11/MY09作為BPV基因分型擴(kuò)增引物，提交引物序列至生工生物工程(上海)股份有限公司并合成。引物序列參見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.3 病料處理

取-20 ℃保存的體表贅生瘤體樣品，經(jīng)研磨處理后以每管20～30 mg做為標(biāo)準(zhǔn)，于1.5 mL滅菌清潔的離心管中分裝，做好標(biāo)記-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病料樣品DNA的提取

具體提取步驟參照Omega公司E.Z.N.A.Tissue DNA Kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，核酸檢測(cè)儀內(nèi)檢測(cè)收集的DNA核酸濃度，封口，標(biāo)記，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PCR檢測(cè)體系

采用50 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：模板DNA 5. 0 μL，ddH2O 18. 0 μL，2×Tap Master Mix 25. 0 μL，引物Primer MY11 1. 0 μL，引物Primer MY09 1. 0 μL，混勻后瞬時(shí)離心。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；47. 5 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定擴(kuò)增片段大小。

取部分PCR產(chǎn)物，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶，拍照。將剩余PCR樣品全部點(diǎn)樣，切膠回收，回收步驟參照天根生物技術(shù)有限公司普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6 T載體連接和產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

取純化產(chǎn)物參照天根T載體連接試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)化連接，提取質(zhì)粒送至北京金锘銳杰基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.7 序列分析

經(jīng)測(cè)序的陽(yáng)性質(zhì)粒，以3次完全相同的結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，作為測(cè)序結(jié)果，將測(cè)序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行在線Blastn比對(duì)，比對(duì)完成后在DNAStar軟件MegAlign中與GenBank中下載的BPV參考毒株進(jìn)行Clustal W核苷酸同源性比對(duì)分析；比對(duì)后序列與參考序列的L1基因利用MEGA 6.0軟件采用鄰近法行系統(tǒng)發(fā)育分析，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。參考序列參見(jiàn)表2。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

患病牛右前肢關(guān)節(jié)處至蹄部可見(jiàn)明顯體表贅生瘤體，呈結(jié)節(jié)乳頭狀瘤，顏色灰褐色至深褐色，大小不等，于膝關(guān)節(jié)至蹄部連接成片，質(zhì)地堅(jiān)硬，粗糙呈菜花狀(圖1)。

表2 GenBank中登錄的BPV參考株序列

圖1 牛乳頭狀瘤臨床癥狀觀察

2.2 病理組織學(xué)觀察

將采集患病牛的皮膚體表贅生瘤經(jīng)病理組織切片觀察后顯示，樣品病理切片表皮細(xì)胞各層增厚，表皮角質(zhì)化過(guò)度，顆粒細(xì)胞部分空泡化，并且存在嗜酸性包涵體(圖2)[5,6]。

注：A：箭頭所示為細(xì)胞空泡化；B：過(guò)度角質(zhì)化

2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果

提取患病牛體表贅生瘤體樣品DNA，通用引物MY11/MY09進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出與預(yù)期大小相符的約為460 bp的片段(圖3)。

注：M：DNA marker D2000；1：空白對(duì)照；2：PCR擴(kuò)增片段圖3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 BPV L1基因核苷酸序列同源性分析

以通用引物MY11/MY09擴(kuò)增得到的序列，經(jīng)測(cè)序后在NCBI中比對(duì)，結(jié)果表明，該測(cè)序序列與BPV-1型參考株的核苷酸同源性達(dá)到99%以上，命名為SY-12。與不同基因型的BPV參考株L1基因核苷酸序列同源性如下：與BPV-1型參考株(X02346和AB626705)的核苷酸同源性分別為99. 5%和99. 1%；與BPV-2型參考株(KC878306)和BPV-13型參考株(JQ798171)的核苷酸同源性均為83. 5%；而與BPV-3型參考株(AF486184)、BPV-4型參考株(X05817)、BPV-5型參考株(AF457465)、BPV-6型參考株(AJ620208)、BPV-7型參考株(NC-007612)、BPV-8型參考株(DQ098913)、BPV-10型參考株(AB331651)、BPV-11型參考株(AB543507)、BPV-12型參考株(JF834523)、BPV-9型參考株(AB331650)分別為60. 8%、56. 6%、62. 0%、59. 0%、59. 4%、62. 5%、57. 3%、57. 8%、62. 7%、59. 7%(圖4)。

圖4 多序列比對(duì)

2.5 遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

依據(jù)不同的BPV基因型L1基因參考序列，用MEGA6.0軟件，采用Neighbor-Joining Method對(duì)SY-12與不同基因型BPV參考株進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)如圖5。從圖中可以看出SY-12與參考株BPV-01型參考株X02346和BPV-1型參考株AB626705位于同一分支為BPV-1型牛乳頭瘤病毒，同時(shí)與BPV-02型參考株KC878306和BPV-13型參考株JQ798171位于同一分支上為Delta屬；證明SY-12株為BPV-1型乳頭瘤病毒；BPV-5型參考株(AF457465)和BPV-8型參考株(DQ098913)位于同一分支上為Epsilon屬；BPV-3型參考株(AF486184)、BPV-4型參考株(X05817)、BPV-11型參考株(AB543507)、BPV-10型參考株(AB331651)、BPV-9型參考株(AB331650)、BPV-6型參考株(AJ620208)、BPV-12型參考株(JF834523)位于同一分支上為Xi屬；BPV-7型參考株(NC-007612)為未被定義的PV屬[7]。

圖5 參照部分L1基因構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)

3 討論

新疆南疆某養(yǎng)殖戶疑似感染患病牛，經(jīng)PCR檢測(cè)、基因序列分析，確定該患牛感染BPV-1。

賀志昊在2014年對(duì)新疆北疆地區(qū)進(jìn)行了BPV流行病學(xué)的調(diào)查，并得出主要流行株為BPV-2[8]；王青青2015年檢測(cè)出新疆南疆BPV-2型[5]；史巧蕓2015年在海南完成了對(duì)BPV-13的研究工作[9]；彭昊2016年在廣西檢測(cè)出BPV-1[10]；張海2017年在貴州檢測(cè)出BPV-2型[11]；證實(shí)在國(guó)內(nèi)，新疆地區(qū)存在BPV不同基因型感染。

常規(guī)的臨床檢查并不能完全確定該病的發(fā)生，易造成漏診、誤診情況的發(fā)生。L1基因是病毒基因組中保守的基因片段，被廣泛用于基因分型。依據(jù)L1基因設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物和通用引物常用于檢測(cè)乳頭狀瘤病毒感染和基因型鑒定[12]。

參照核苷酸同源性比對(duì)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，新疆南疆牛乳頭瘤病毒序列SY-12株與BPV-01型參考株(X02346和AB626705)的核苷酸同源性分別為99. 5%和99. 1%，均為BPV-1型，并且與BPV-02型參考株KC878306和BPV-13型參考株JQ798171位于同一分支上為Delta屬。通過(guò)核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SY-12株病毒基因型與BPV-01型參考株X02346的核苷酸同源性達(dá)到99. 5%，均為Delta屬。

通過(guò)對(duì)新疆南疆BPV-1型SY-12株的基因分型鑒定，為下一步研究BPV-1型全長(zhǎng)基因序列奠定基礎(chǔ)，為后續(xù)新疆南疆地區(qū)動(dòng)物感染乳頭瘤病毒流行病學(xué)研究及病毒基因數(shù)據(jù)庫(kù)的建立具有重要意義。