魏燕超，翁 霞，王新雨

( 1.陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710000;2.鞍山師范學院 化學與生命科學學院,遼寧 鞍山 114007; 3.鞍山市第八中學,遼寧 鞍山 114031)

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)藥除病蟲、雜草的功效至關重要[1-2]，但由于農(nóng)藥的不合理使用，導致農(nóng)藥殘留的現(xiàn)象時有發(fā)生[3-4].而具有價格低廉、防治對象多、使用范圍廣等優(yōu)點的有機磷農(nóng)藥在農(nóng)藥殘留中名列全茅[5-6].陳煥娟檢測95份蔬菜樣品，有機磷類農(nóng)藥檢出率高達21.1%[6]，王保成檢測160份蔬菜，有機磷農(nóng)藥檢出率為16.25%;其中，24份蔬菜農(nóng)殘含量超標[7].王占成檢測222份果蔬發(fā)現(xiàn)9類果蔬中農(nóng)藥殘留總超標率高達54.5%，而有機磷類農(nóng)藥超標率高達60.81%[8].

現(xiàn)階段農(nóng)藥殘留檢測方法主要有色譜法、光譜法和快速檢測法.而較好滿足市場需求的快速檢測法又包括酶抑制法、生物傳感器法和免疫法.酶抑制法又因易操作、低成本、測時短等優(yōu)點受基層檢測部門的青睞，同時也被列入國家標準[9].酶抑制法常用的酶主要是來自于動物的膽堿酯酶和來自于植物的植物酯酶，而植物酯酶由于原料來源廣、價格低、提取簡單、敏感性優(yōu)于膽堿酯酶而廣受歡迎[10].其原理是植物酯酶能分解α-乙酸萘酯產(chǎn)生萘酚,而萘酚與固藍B鹽作用生成紫紅色偶氮化合物,從而發(fā)生顯色反應.有機磷農(nóng)藥能抑制植物酯酶的活性，使得植物酯酶不能催化顏色反應繼續(xù)發(fā)生.即導致不能產(chǎn)生萘酚或產(chǎn)生少量萘酚，反應最終顯色淺或不顯色.所以可用底物分解后產(chǎn)物的吸光度值A來表示酶的活性和農(nóng)藥的殘留量，即吸光度值越大，酶的活性越大，農(nóng)藥殘留越少.所以本研究選取最常見的小麥為原材料，確定其提取及反應的最優(yōu)條件，以期為果蔬農(nóng)藥殘留的快速檢測提供一定的理論指導.

1 材料與方法

1.1 材料

小麥粉(鞍山某超市售);α-乙酸萘酯(分析純);固藍B鹽(分析純)；磷酸氫二鈉(分析純);磷酸二氫納(分析純);無水乙醇(分析純);敵敵畏.

實驗所用儀器TU-18紫外可見分光光度計；80-2B低速臺式離心機；BRAND移液槍；PL-2002電子天平；PB-10 pH計.

1.2 方法

1.2.1 顯色基質(zhì)的配制 將100 mg α-乙酸萘酯溶于80 mL無水乙醇中作為基液，將125 mg固藍B鹽溶于80 mL蒸餾水中作為顯色液，再將基液和顯色液按1∶9的比例混合成顯色基質(zhì)液(現(xiàn)配現(xiàn)用).

將敵敵畏配制成1.0 mg/L的溶液，均勻地噴灑于白菜上，靜置8 h后，將蔬菜正常沖洗，用于后續(xù)試驗.

1.2.2 小麥酯酶的提取 分別稱取10.00 g小麥粉于錐形瓶中，按料液比(g/mL)1∶4加入蒸餾水攪拌，浸泡24 h，再倒入離心管中以4 000 r/min離心10 min，取上清液即為酶液，于4 ℃下保存.

2 結果與討論

2.1 最大吸收波長的確定

將2 mL pH=6 磷酸鹽緩沖溶液加入試管，再分別移取顯色基質(zhì)液200 μL、酶液100 μL使之充分混合.用pH=6 磷酸鹽緩沖溶液為空白對照，在400～600 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，實驗得出酶促反應的最大吸收波長為520 nm，見圖1.以下測定均在該波長下進行.

2.2 單因素結果分析

2.2.1 最適酶促反應時間 在2 mL pH=6 磷酸鹽緩沖溶液、酶液100 μL、顯色基質(zhì)液200 μL、顯色溫度35 °C的條件下，測定在5，10，15，20，25 min時紫紅色偶氮化合物的吸光度值，確定出酶促反應的最適顯色時間為15 min，見圖2.

酶抑制法中抑制時間是檢測的關鍵因素，時間短會使得抑制不充分，導致結果有出入；時間過長不僅會增加檢測時間又會使得酶活性下降.如李順等人研究發(fā)現(xiàn)最佳抑制時間分別是12,15,30 min[11-13]，這可能是農(nóng)藥濃度、水浴溫度等不同而導致時間有差異.

圖1 植物酯酶的最大吸收波長曲線 圖2 酶促反應時間曲線

2.2.2 最適酶促反應溫度 在2 mL pH=6 磷酸鹽緩沖溶液、酶液100 μL、顯色基質(zhì)液200 μL、顯色時間15 min的條件下，測定在 25，30，35，40，45 °C的反應溫度下紫紅色偶氮化合物的吸光度值，確定出酶促反應的最適溫度為35 °C，見圖3.

姜璐研究發(fā)現(xiàn)酯酶的最佳酶活力的水浴溫度為40 °C，但純化后的酯酶在30～40 °C均有較高的穩(wěn)定性，這與本試驗的結果相一致.

2.2.3 最適酶促反應酶液量 在2 mL pH=6磷酸鹽緩沖溶液、顯色基質(zhì)液200 μL、顯色時間15 min、顯色溫度35 °C的條件下，測定在50，100，150，200，250 μL的酶液量下紫紅色偶氮化合物的吸光度值，確定出酶促反應的最適酶液量為100 μL，見圖4.

李順研究發(fā)現(xiàn)酶液量在50～100 μL時,酶抑制率增加最顯著,大于100 μL后,酶抑制率變化不顯著[11]，這與本研究結果相一致.但本文發(fā)現(xiàn)酶液量大于200 μL后吸光度值呈下降趨勢，這也可能是由于此時酶液量過多，酶促反應時間相對較短導致.

圖3 酶促反應溫度曲線 圖4 酶促反應酶液量曲線

圖5 酶促反應pH值曲線

2.2.4 最適酶促反應pH值 分別取2 mL pH=5.5，pH=6，pH=6.5,pH=7,pH=7.5 磷酸鹽緩沖溶液，在酶用量100 μL、顯色基質(zhì)液200 μL、顯色時間15 min、顯色溫度35 °C的條件下，測定紫紅色偶氮化合物的吸光度值，確定出酶促反應的最適pH=6.0，見圖5.

2.3 正交試驗確定酶促反應的最優(yōu)條件

由表1可以看出，酶液量極差最大，其次分別為顯色溫度、顯色時間、pH.即各因素的主次順序為D>B>A>C.酶反應條件最優(yōu)水平組合為A3B2C1D3,經(jīng)實驗證實得，即顯色時間為20 min,顯色溫度為35 °C，pH為5.5，酶液量為150 μL為最佳條件.

由表1可以看出，D因素影響顯著性差異，A、B、C無顯著性差異.因此，酶液量對酶促反應的影響達到了顯著水平，而溫度、時間、pH值對酶促反應不顯著.

表1 正交試驗設計及數(shù)據(jù)處理

表2 方差分析表

2.4 驗證試驗

選正交試驗中的最佳條件，即顯色時間20 min、顯色溫度35 °C、pH=5.5、酶液量150 μL做驗證實驗，得出A3B2C1D3組為這9組中的最優(yōu)組合.即重復測定3次的吸光度值分別為0.671，0.669，0.675，平均值為0.672.

3 結論

本試驗選用小麥酯酶，研究了酶抑制法檢測有機磷農(nóng)藥殘留的反應條件，通過單因素實驗和L9(34)正交試驗最終確定小麥酯酶酶促反應的最佳條件為顯色時間20 min、顯色溫度35 °C、pH=5.5、酶液量150 μL.