張慶 商延 朱見深 劉曉文 宋勝敏 柳林 由佳 朱應(yīng)民 齊靜 李璐璐 胡明 戴美學(xué) 劉玉慶

摘要：噬菌體是侵襲細(xì)菌的病毒，也是病毒中最普遍、分布最廣的類群。為了防止噬菌體侵染，細(xì)菌進(jìn)化出多種多樣的防御機(jī)制；而為了突破這些防御機(jī)制，噬菌體也進(jìn)化得到了相對(duì)應(yīng)的反制策略。本文即綜述了這一領(lǐng)域的研究進(jìn)展，有助于理解噬菌體與宿主細(xì)菌的共存共進(jìn)化機(jī)制，合理利用噬菌體。

關(guān)鍵詞：噬菌體；細(xì)菌宿主；防御機(jī)制；反防御機(jī)制

中圖分類號(hào)：S852.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）07-0048-07

Abstract Bacteriophage， the virus of bacteria， is the worlds largest and most abundant organism of virus. On one hand， bacteria have developed various defense mechanisms to prevent phage infection， and on the other hand， phages have also evolved corresponding countermeasures to break through these defense mechanisms. In this paper，the research progress in this field was reviewed to understand the co-evolution mechanism between phage and host bacteria， so as to facilitate the rational use of phage.

Keywords Phage； Host bacteria； Defense mechanism； Anti-defense mechanism

Twort[1]與d′Hérelle[2]分別于1915年和1917年獨(dú)立發(fā)現(xiàn)噬菌體。噬菌體治療的早期結(jié)果給人很大希望，但后來因?yàn)椴涣嫉膶?duì)照試驗(yàn)以及前后矛盾的結(jié)果，有關(guān)其治療細(xì)菌感染的功效與再現(xiàn)性引起了巨大爭(zhēng)論。而1928年青霉素以及隨后各類抗生素的相繼發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，使得噬菌體研究基本中斷。近年來隨著細(xì)菌抗藥性的不斷升高以及多重耐藥菌的出現(xiàn)[3]，噬菌體作為一種并行不悖的抗菌劑重新展現(xiàn)了它的潛力。

噬菌體與宿主在自然界形成了共進(jìn)化平衡。不論是在食品生產(chǎn)領(lǐng)域還是為了明確噬菌體治療策略，亦或是著眼于噬菌體在環(huán)境變化進(jìn)程中所起到的必要作用，都需要我們深入地研究噬菌體與細(xì)菌相互作用的機(jī)制。本文綜述了吸附阻斷、限制修飾系統(tǒng)、CRISPR-Cas系統(tǒng)、流產(chǎn)性感染等細(xì)菌的抗病毒策略以及噬菌體用來對(duì)抗或者規(guī)避這些策略的反制策略。

1 宿主抵抗噬菌體的防御機(jī)制

裂解性噬菌體侵染宿主的周期包括吸附、侵入、增殖、成熟與裂解釋放五個(gè)階段。為了從噬菌體的感染中存活下來，宿主菌必須在噬菌體顆粒成熟釋放之前采取策略遏制噬菌體的傳播和增殖，因此針對(duì)吸附、侵入、增殖這幾個(gè)步驟細(xì)菌發(fā)展出了多種多樣的防御機(jī)制。

1.1 阻斷吸附

噬菌體侵染細(xì)菌的第一步即噬菌體吸附到細(xì)菌表面，眾所周知噬菌體具有高度專一性，只特異性裂解一種或一類細(xì)菌，在噬菌體識(shí)別并吸附到特定宿主細(xì)胞表面這一過程中，噬菌體受體起著至關(guān)重要的作用。在長(zhǎng)期的共進(jìn)化過程中，細(xì)菌已進(jìn)化出紛繁復(fù)雜的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)來從源頭阻斷噬菌體的侵入。目前這一吸附阻斷機(jī)制主要可劃分為三類，即受體的阻塞、細(xì)胞外基質(zhì)的覆蓋以及競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的競(jìng)爭(zhēng)抑制。

1.1.1 阻塞受體 細(xì)菌可以通過改變其細(xì)胞表面受體的結(jié)構(gòu)來阻礙噬菌體的識(shí)別。例如可以感染大腸桿菌的T5噬菌體在大腸桿菌表面的受體為FhuA（ferrichrome-iron receptor），可以為一種LIp蛋白（lipoprotein）所阻斷，而有趣的是這一蛋白是由T5噬菌體自身基因所編碼的[4]。在侵入的初始階段表達(dá)的LIp蛋白可以防止重復(fù)感染，并且可以結(jié)合到已被裂解細(xì)胞的游離受體上防止新合成的病毒顆粒的無效結(jié)合，從而提高感染效率[5]。類似的機(jī)制還存在于噬菌體BF23中[6]。在許多T偶數(shù)噬菌體中，外膜蛋白A（OmpA）是噬菌體的受體，其構(gòu)象可以被另一種由F質(zhì)粒編碼的外膜脂蛋白TraT修飾從而失去受體活性[7]。又如在金黃色葡萄球菌中，結(jié)合在細(xì)菌表面的蛋白A可能通過覆蓋噬菌體受體的位點(diǎn)來抑制相應(yīng)噬菌體的吸附[8]。

1.1.2 細(xì)胞外基質(zhì)的覆蓋作用 細(xì)胞外基質(zhì)是包繞在細(xì)胞外的一層復(fù)雜且動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，其成分多種多樣，包含有膠原蛋白、蛋白聚糖/糖胺聚糖、彈性蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白以及其他幾種糖蛋白類。這些成分都含有相互作用位點(diǎn)以及與細(xì)胞膜、細(xì)胞表面受體結(jié)合的位點(diǎn)，以使得整個(gè)胞外基質(zhì)成為一個(gè)整體[9]。而噬菌體識(shí)別吸附的受體也被包埋在其中，因此細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成了一道噬菌體侵染細(xì)菌細(xì)胞的物理屏障。

1.1.3 競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑是一類自然存在于環(huán)境中的分子，具有特異性結(jié)合噬菌體受體的特性。例如大腸桿菌的B12/BF23受體，既可以協(xié)助維生素B12的轉(zhuǎn)運(yùn)和作為大腸桿菌素的受體，又可以作為噬菌體BF23的受體。當(dāng)維生素B12的濃度在0.5～2.0 nmol/L時(shí)，BF23的吸附效率被抑制50%，同時(shí)BF23也可以抑制維生素B12的轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。又如FhuA門控回路作為噬菌體T1、T5和φ80的特異性結(jié)合靶點(diǎn)[11]，可以被抗菌肽MccJ25（小菌素J25）結(jié)合從而抑制噬菌體的吸附。

1.2 阻斷DNA侵入

細(xì)菌主要利用超感染免疫（superinfection exclusion， Sie）[12]系統(tǒng)阻止噬菌體DNA的侵入。超感染免疫是宿主菌被一種噬菌體感染后，當(dāng)另一種類似噬菌體吸附于該宿主細(xì)胞表面時(shí)，一些可能錨定到膜上或與膜上元件關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)就會(huì)發(fā)揮作用，從而阻止相似噬菌體引起的繼發(fā)感染（secondary infection）[13]。由此不難看出，競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑在噬菌體-噬菌體相互作用中的意義可能要大于在噬菌體-宿主的相互作用中，也有研究發(fā)現(xiàn)，編碼競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的基因經(jīng)常出現(xiàn)于前噬菌體中，意味著該基因可能是從已經(jīng)侵入過宿主菌的噬菌體中獲得。

以研究較為透徹的大腸桿菌T4為例，存在兩種超感染免疫系統(tǒng)——Imm[14]和Sp[15]。編碼Imm蛋白的基因位于T4噬菌體DNA代謝相關(guān)的基因簇中，Imm蛋白不能獨(dú)立發(fā)揮作用，而是通過結(jié)合到噬菌體DNA注入位點(diǎn)的元件上改變其構(gòu)象來發(fā)揮作用[16]。而Sp可以抑制T4噬菌體上蛋白質(zhì)5的溶菌酶活性，該蛋白質(zhì)位于尾絲底座上，可能通過酶促降解細(xì)胞周質(zhì)層產(chǎn)生穿孔使得尾管穿過細(xì)胞質(zhì)膜[17]。另外，能感染腸桿菌及相關(guān)革蘭氏陰性菌的P1噬菌體中也存在超感染免疫sim基因[18]，攜帶溶原性噬菌體P22的鼠傷寒沙門氏菌的超感染免疫系統(tǒng)SieA可以防止噬菌體L、MG178的感染[19]。

除上述革蘭氏陰性菌外，在少數(shù)革蘭氏陽性菌中也發(fā)現(xiàn)了類似的機(jī)制，以乳酸乳球菌與嗜熱鏈球菌為例。乳酸乳球菌是一類乳品行業(yè)中廣泛應(yīng)用的細(xì)菌，由噬菌體污染所造成的損失使人們?cè)絹碓疥P(guān)注噬菌體防護(hù)的研究。該類菌中的超感染免疫系統(tǒng)（Sie2009）首先發(fā)現(xiàn)于一種歸屬于P335型的溫和噬菌體Tuc2009中，研究推測(cè)該類系統(tǒng)可能廣泛分布于乳球菌屬中[20]，而之后在乳球菌屬中也的確陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了類似的阻斷機(jī)制[21]。嗜熱鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的類似系統(tǒng)為溫和噬菌體TP-J34編碼，產(chǎn)物蛋白Ltp可能干擾噬菌體DNA從頭部注射進(jìn)細(xì)胞的過程[22]。近年也在其他的嗜熱鏈球菌溫和噬菌體中發(fā)現(xiàn)了Ltp類蛋白，如TP-EW、TP-DSM20617和TP-778[23]。

1.3 切割侵入核酸

1.3.1 限制修飾系統(tǒng) 限制修飾系統(tǒng)（R-M system）是目前研究得最深入的噬菌體抗性機(jī)制，存在于超過90%的細(xì)菌與古細(xì)菌中[24]，主要分為四種類型Ⅰ～Ⅳ。該系統(tǒng)主要由甲基轉(zhuǎn)移酶與限制性核酸內(nèi)切酶配合發(fā)揮作用：甲基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)修飾自源核酸，未被修飾的以及外源侵入的DNA則被限制酶酶切裂解。細(xì)菌宿主利用該系統(tǒng)抵御噬菌體侵入也較為廣泛，例如單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌[25]、大腸桿菌[26，27]、乳酸乳球菌[28，29]、弧菌的整合性接合元件中[30]、沙門氏菌[31，32]等等都含有該系統(tǒng)。

1.3.2 CRISPR-Cas系統(tǒng) 成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）及其相關(guān)基因Cas （CRISPR-associated）于1987年被發(fā)現(xiàn)[33]，并在2005年被確定是一種細(xì)菌防御外源核酸的免疫系統(tǒng)[34，35]。當(dāng)被噬菌體感染后，CRISPR基因座重復(fù)間隔區(qū)的5′端會(huì)增加一段與侵染噬菌體完全同源的序列，當(dāng)同種噬菌體再次感染時(shí)，細(xì)菌就會(huì)對(duì)其產(chǎn)生抗性。近年來，在越來越多的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了該系統(tǒng)。

1.4 流產(chǎn)性感染

流產(chǎn)性感染/頓挫感染（abortive infection， Abi）系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致被感染的細(xì)胞死亡，常不產(chǎn)生成熟的病毒顆粒。盡管對(duì)該系統(tǒng)的研究已有幾十年，但因?yàn)锳bi系統(tǒng)的復(fù)雜多樣性，我們對(duì)其作用方式仍然不盡了解，可以總結(jié)出的共性是Abi蛋白都是一些休眠蛋白，并會(huì)在噬菌體侵入后被活化，引起細(xì)胞水平的抑制并且干擾一些必要的代謝過程。以革蘭氏陽性菌中的乳酸乳球菌為例，目前已發(fā)現(xiàn)的Abi系統(tǒng)就有20余種[36]，這些幾乎都是由質(zhì)粒編碼，其作用方式不盡相同，蛋白質(zhì)同源性也很少。

革蘭氏陰性菌中的Abi系統(tǒng)，以大腸桿菌為例，首先被發(fā)現(xiàn)的是RexA/RexB系統(tǒng)[37]：當(dāng)噬菌體侵入細(xì)胞，復(fù)制與重組的中間產(chǎn)物——一種蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物使得RexA活化，兩個(gè)RexA激活RexB，RexB在膜上形成離子通道導(dǎo)致膜電位去極化、胞內(nèi)ATP減少，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。其他研究比較廣泛的還有諸如Lit和PrrC系統(tǒng)，Lit系統(tǒng)通過切割翻譯延長(zhǎng)因子Tu導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成中斷，而PrrC蛋白則是切割tRNALys的反密碼環(huán)，兩者都作用于翻譯環(huán)節(jié)[37]。

毒素-抗毒素系統(tǒng)（toxin-antitoxin system， TA）是一種細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒維持自身穩(wěn)定的系統(tǒng)。這類系統(tǒng)包含兩類蛋白——毒素蛋白和抗毒素蛋白，抗毒素蛋白不穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞分裂后，抗毒素被降解，毒素就會(huì)殺死細(xì)胞，只有當(dāng)編碼抗毒素的質(zhì)粒存在于子細(xì)胞中時(shí)才能保持細(xì)胞生存[38]。近來發(fā)現(xiàn)該類系統(tǒng)中的一部分還與Abi有關(guān)[39]，即噬菌體入侵后會(huì)啟動(dòng)TA系統(tǒng)導(dǎo)致宿主細(xì)胞自殺，感染流產(chǎn)。

2 噬菌體抵抗宿主防御機(jī)制

雖然宿主細(xì)菌有多種防御噬菌體的策略，但仍有很大比例的細(xì)菌被噬菌體裂解，這得益于噬菌體進(jìn)化出的各種對(duì)抗細(xì)菌防御的方式。

2.1 對(duì)抗吸附阻礙

針對(duì)受體結(jié)構(gòu)被改變，部分噬菌體進(jìn)化出了一種被稱作多樣性引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄因子（diversity-generating retroelements DGRs）的遺傳元件，該元件在依賴模板的逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的作用過程下可以在噬菌體基因mtd （major tropism determinant）中引入核苷酸置換，該基因編碼的蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)宿主的識(shí)別，因而可以改變或者拓寬噬菌體的宿主譜[40，41]。近年研究發(fā)現(xiàn)這一元件廣泛分布在細(xì)菌基因組（前噬菌體）及其他噬菌體基因組中[42]。此外，還有許多噬菌體通過改變受體結(jié)合蛋白或者尾絲結(jié)構(gòu)來識(shí)別新的宿主表面受體。例如，噬菌體λ通過改變受體結(jié)合相關(guān)蛋白J的末端結(jié)構(gòu)域使得其自身不僅可以識(shí)別原來的受體LamB，也可以識(shí)別宿主變異后的受體OmpF[43]。

針對(duì)宿主表面受體被覆蓋的情況，噬菌體可以借助酶來裂解胞外的物理屏障，暴露出被包埋的受體。例如，裂解酶和水解酶都可以降解胞外多糖[44，45]，這些酶有的綁定到受體結(jié)合蛋白上，也有的可以游離存在。此外，鏈球菌屬的烈性與溫和噬菌體含有的透明質(zhì)酸酶可以降解胞外莢膜的透明質(zhì)酸成分[46]。

一項(xiàng)最近的研究還發(fā)現(xiàn)，噬菌體抗性菌在與敏感型細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)時(shí)會(huì)偶爾發(fā)生被噬菌體裂解的現(xiàn)象。研究人員稱其為獲得性敏感（ASEN），解釋該現(xiàn)象是由抗性細(xì)胞瞬時(shí)獲得了附近敏感型細(xì)胞表面的噬菌體附著分子造成的，并證明這一交換是由膜性小泡驅(qū)動(dòng)的[47]。

2.2 對(duì)抗R-M系統(tǒng)

首先，R-M系統(tǒng)切割噬菌體DNA的效率與病毒基因組中的限制性位點(diǎn)是成比例的，因此通過減少或改變限制性位點(diǎn)噬菌體可以有效地規(guī)避R-M系統(tǒng)。例如EcoRⅡ限制位點(diǎn)[5′-CC（A/T）GG]需要至少兩個(gè)才能激發(fā)R-M系統(tǒng)的活性，而且對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)之間的距離有一定的要求[48]；而噬菌體T3和T7中的位點(diǎn)相距太遠(yuǎn)致使R-M系統(tǒng)不能對(duì)其進(jìn)行切割。對(duì)于噬菌體基因組的修飾，例如大腸桿菌噬菌體Mu基因組的腺嘌呤可以被Mom修飾為N6-（1-乙酰）-腺嘌呤從而躲過R-M系統(tǒng)[49]；類似的還有一些枯草芽孢桿菌的噬菌體將自身的胸腺嘧啶替換為尿嘧啶或者羥甲基尿嘧啶，更多修飾類型詳見文獻(xiàn)[50]。另外識(shí)別位點(diǎn)序列在DNA雙鏈上的取向也會(huì)影響R-M系統(tǒng)的識(shí)別[51]。

噬菌體還可以將識(shí)別位點(diǎn)保護(hù)起來以逃避R-M系統(tǒng)的識(shí)別。如噬菌體P1，蛋白質(zhì)DarA和DarB會(huì)同DNA一起注入宿主細(xì)胞中，兩種蛋白結(jié)合到噬菌體DNA上使得Ⅰ類R-M系統(tǒng)的識(shí)別位點(diǎn)被覆蓋[52]。

另有一些噬菌體可以直接作用于R-M系統(tǒng)使其酶活改變。例如λ噬菌體編碼的一種抗限制性酶切蛋白R(shí)al可以增強(qiáng)Ⅰ類R-M系統(tǒng)中修飾酶的活性，使得DNA注入細(xì)胞后被迅速大量修飾，減輕限制性內(nèi)切酶的作用[53]。在Ⅰ類與Ⅲ類R-M系統(tǒng)中，其酶發(fā)揮活性需要一種輔因子S-腺苷甲硫氨酸，而噬菌體T3可以在侵染后快速產(chǎn)生一種S-腺苷甲硫氨酸水解酶水解該輔因子使得R-M系統(tǒng)被抑制，值得注意的是，該水解酶不會(huì)對(duì)已經(jīng)與輔因子結(jié)合的R-M酶產(chǎn)生影響而只是阻止新合成的R-M酶與其輔因子結(jié)合[54]。

2.3 對(duì)抗CRISPR-Cas系統(tǒng)

噬菌體對(duì)于CRISPR-Cas系統(tǒng)的反制措施，主要包括點(diǎn)突變或者核苷酸刪除。替換或刪除的位置可以是在前間區(qū)，也可以在前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif， PAM）中[55]。但是近來一項(xiàng)對(duì)于大腸桿菌CRISPR-Cas亞型的研究發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)突變發(fā)生在緊鄰PAM前間區(qū)序列中一段只有七個(gè)核苷酸的種子區(qū)時(shí)，噬菌體才能逃過CRISPR-Cas的免疫作用[56]。

CRISPR-Cas系統(tǒng)存在于48%的細(xì)菌與95%的古細(xì)菌中[57]，而點(diǎn)突變頻率很低，那么是什么原因使得噬菌體在如此普遍又有效的系統(tǒng)下還能增殖擴(kuò)散的呢？近來一項(xiàng)研究給出了一個(gè)可能的答案。該研究在感染銅綠假單胞菌的噬菌體中發(fā)現(xiàn)了五種抗CRISPR基因（anti-CRISPR genes），這類基因編碼的蛋白質(zhì)不影響CRISPR小RNA （small CRISPR RNAs， crRNAs）以及Cas蛋白的形成，而是在crRNA-Cas復(fù)合物形成后發(fā)揮作用[58]。

2.4 對(duì)抗流產(chǎn)性感染系統(tǒng)

同抵抗CRISPR-Cas系統(tǒng)類似，噬菌體也可以通過基因突變來抗衡Abi系統(tǒng)。例如，噬菌體T4rⅡ中基因motA的突變可以使其逃過宿主Rex系統(tǒng)的清除[59，60]。又如噬菌體T4的gol變異株可以使Lit蛋白不被激活從而躲過Lit流產(chǎn)性感染系統(tǒng)[61]。在廣泛發(fā)現(xiàn)Abi系統(tǒng)的乳酸乳球菌中，突變導(dǎo)致的Abi抗性也普遍存在[62，63]。

在TA系統(tǒng)介導(dǎo)的噬菌體Abi表型中也存在規(guī)避機(jī)制。噬菌體可以自身編碼一種抗毒素來中和細(xì)胞內(nèi)的毒素，不使宿主細(xì)胞死亡。例如T4噬菌體的Dmd蛋白[64]、黑脛病菌噬菌體φTE編碼的偽ToxⅠ蛋白[65]等等。

3 展望

噬菌體與細(xì)菌在億萬年的共進(jìn)化過程中彼此都進(jìn)化出了多種多樣的反制策略，而這也不斷豐富著它們的遺傳多樣性。通過水平基因傳遞和突變等方式，噬菌體與細(xì)菌不斷更新著自身的遺傳元件。兩者作為自然界中最為豐富的微生物，可以說在世界上任何一個(gè)角落都同時(shí)存在著它們的身影，也不斷發(fā)生著此消彼長(zhǎng)的生存競(jìng)爭(zhēng)。

得益于測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步與分子生物學(xué)的發(fā)展，迄今為止我們已發(fā)現(xiàn)的諸多細(xì)菌的抗病毒策略以及噬菌體的反制策略，大多基于雙鏈DNA病毒。而自然界中還存在著許多針對(duì)單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA噬菌體的細(xì)菌防御系統(tǒng)以及這些噬菌體用來躲避這些防御系統(tǒng)的策略，等待著我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)。而在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的多種策略中，也有很多分子機(jī)制我們尚不明確。

在實(shí)驗(yàn)室中研究噬菌體-細(xì)菌共進(jìn)化，通常是一對(duì)一地進(jìn)行。而自然狀態(tài)下，噬菌體與細(xì)菌必然是多種多樣的群落混雜在一起，在此情況下，細(xì)菌針對(duì)一種噬菌體可能會(huì)采取多種防御策略聯(lián)合抵抗，反之亦然。因此，模擬自然環(huán)境下噬菌體-細(xì)菌相互作用的實(shí)驗(yàn)應(yīng)該盡快展開。隨著全球范圍內(nèi)對(duì)噬菌體研究的重新興起，我們期望有一天能夠利用噬菌體來控制或改造自身及生態(tài)環(huán)境中其他微生物的群落結(jié)構(gòu)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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