李澤爭(zhēng)，王 利，曹愛麗，彭 文

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200062）

糖尿病腎病（DN）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，亦是導(dǎo)致終末期腎臟衰竭（ESRD）的重要原因[1-2]。足細(xì)胞是一種高度分化的細(xì)胞類型，在維持腎小球結(jié)構(gòu)、構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障方面發(fā)揮著重要作用。有研究證實(shí)，足細(xì)胞損傷在DN發(fā)展過程中意義重大[3-4]。越來越多的研究證明足細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)的變化可預(yù)測(cè)DN的發(fā)生發(fā)展，抑制足細(xì)胞的損傷可能會(huì)阻止或減緩DN的疾病進(jìn)程，但目前為止足細(xì)胞損傷的機(jī)制仍不明確，亦缺乏有效防治足細(xì)胞損傷的干預(yù)手段。

白藜蘆醇（RSV）是一種植物抗毒素，有研究發(fā)現(xiàn)RSV可顯著降低蛋白尿，具有明確的腎臟保護(hù)功能，此外其在保護(hù)足細(xì)胞方面也表現(xiàn)出巨大潛力[5]，然而活化過程尚未完全明確。本研究采用體外高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型，觀察RSV對(duì)足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及涉及的可能分子機(jī)制，以期為臨床上防治DN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要材料 FBS、胰酶、RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；RSV（上海同田生物技術(shù)股份有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó) Sigma公司）；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司）；dihydroethidium（美國(guó) Sigma公司）；JC-1、MitoSOX Red（美國(guó) Thermos Fisher Scientific公司）；β-actin、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）3、caspase 9（美國(guó) Cell Signaling Technology公司）。RSV溶于DMSO（終濃度≤0.1%）中，配置成儲(chǔ)存液，避光，4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 足細(xì)胞培養(yǎng) 永生化小鼠足細(xì)胞株是從H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟分離后建立的細(xì)胞系，由美國(guó)Mount Sinai醫(yī)學(xué)院Mundel教授授權(quán)，上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院汪年松教授轉(zhuǎn)贈(zèng)，傳代數(shù)≤15代。

1.2.2 細(xì)胞分組及干預(yù)方法 1）對(duì)照組：5 mmol/L低糖培養(yǎng)液（LG）；2）模型組：30 mmol/L 高糖培養(yǎng)液（HG）；3）RSV 干預(yù)組：①HG+5 μmol/L RSV；②HG+10 μmol/L RSV，RSV提前干預(yù)2 h后高糖孵育48 h。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 足細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，消化收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗2 次，加入 200 μL 1×Binding Buffer混勻，避光加入5 μL Annexin V，室溫放置 15 min，加入 PI 5 μL，重懸細(xì)胞上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 ROS檢測(cè) DHE稀釋至無血清培養(yǎng)基，終濃度為10 μmol/L。細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，加入稀釋的DHE，37℃孵育20 min，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，即刻置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 JC-1染色 足細(xì)胞接種于內(nèi)置無菌細(xì)胞爬片的6孔板，干預(yù)后吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，加入 2 μmol/L JC-1，37 ℃孵育 30 min，PBS 洗 2次，4%多聚甲醛固定10 min，封片，置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 MitoSOX染色 足細(xì)胞接種于內(nèi)置無菌細(xì)胞爬片的6孔板，干預(yù)后吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，加入稀釋的 5 μmol/L MitoSOX，37 ℃孵育 10 min，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，封片，置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 Western blot檢測(cè) 細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后加入蛋白裂解液（含蛋白酶抑制劑）充分裂解，高速低溫離心留取上清，提取蛋白并檢測(cè)含量，取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫?fù)u床封閉1 h，依次加入一抗（β-actin、caspase 3、caspase 9），4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫?fù)u床1 h，在Image QuantLAS 500成像系統(tǒng)中進(jìn)行顯影。以β-actin的蛋白表達(dá)為內(nèi)參照，結(jié)果以靶蛋白/內(nèi)參的灰度比值表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）形式表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSV對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞的保護(hù)作用 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，高糖孵育可顯著提高足細(xì)胞的早期凋亡與晚期凋亡。與HG組相比，RSV干預(yù)后，細(xì)胞凋亡出現(xiàn)不同程度的抑制，且隨著藥物濃度升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 1，表 1。

圖1 RSV對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of RSV on podocyte apoptosis

表1 RSV對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響（±s）Tab.1 Effect of RSV on podocyte apoptosis(±s)

表1 RSV對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響（±s）Tab.1 Effect of RSV on podocyte apoptosis(±s)

注：與 LG 組比較，*P＜0.05；與 HG 組比較，#P＜0.05。

凋亡細(xì)胞（%）8.53±1.27 47.00±7.56*28.33±2.08#21.00±3.46#組別LG組HG組HG+5 μmol/L RSV 組HG+10 μmol/L RSV 組

2.2 RSV對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響 ROS在足細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用，本研究采用熒光探針DHE觀察足細(xì)胞內(nèi)ROS生成情況。結(jié)果顯示，與LG組相比，高糖孵育可明顯提高細(xì)胞內(nèi)ROS生成，且RSV可劑量依賴性的抑制高糖誘導(dǎo)的ROS表達(dá)水平。見圖2。

2.3 RSV對(duì)線粒體膜電位的影響 線粒體膜電位下降發(fā)生在線粒體功能障礙的早期，本研究以JC-1熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位。當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，以聚合體形式呈現(xiàn)，產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，以單體形式呈現(xiàn)，產(chǎn)生綠色熒光。激光共聚焦結(jié)果顯示，RSV干預(yù)后，綠色熒光向紅色熒光轉(zhuǎn)變?cè)龆?，提示RSV可有效抑制高糖誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降。見圖3。

2.4 RSV對(duì)線粒體ROS生成的影響 采用線粒體超氧陰離子染料MitoSOX檢測(cè)線粒體ROS。結(jié)果提示高糖可顯著提高足細(xì)胞線粒體ROS的產(chǎn)生，RSV可劑量依賴性的降低線粒體ROS的表達(dá)水平。見圖4。

圖2 RSV對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響（倒置熒光顯微鏡×200）Fig.2 Effect of RSV on the intracellular ROS generation（inverted fluorescence microscope ×200）

2.5 Western blot檢測(cè) caspase 3、caspase 9 的表達(dá)與 LG組相比，HG組 cleaved caspase 3、cleaved caspase 9表達(dá)水平顯著上調(diào)；隨RSV干預(yù)濃度的提高，與 HG 組相比，cleaved caspase 3、cleaved caspase 9表達(dá)水平逐漸降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 5。

3 討論

圖3 RSV對(duì)線粒體膜電位的影響（激光共聚焦×400）Fig.3 Effect of RSV onmitochondrial membrane potential（laser confocal×400）

圖4 RSV對(duì)線粒體ROS的影響（激光共聚焦×400）Fig.4 Effect of RSV onROS generation inmitochondrial（laser confocal×400）

圖5 RSV對(duì)線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的影響Fig.5 Effect of RSV on protein related to mitochondrial apoptosis pathway

DN是一種糖尿病的長(zhǎng)期并發(fā)癥，以蛋白尿和腎小球硬化為病理特征，臨床中約40%的Ⅰ型及30%的Ⅱ型糖尿病患者最終會(huì)發(fā)展為DN。足細(xì)胞又稱為臟層腎小球上皮細(xì)胞，與內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜共同構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障。研究表明，DN早期便伴有足細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為足細(xì)胞密度的降低和數(shù)量的減少。由于足細(xì)胞增生分化能力有限，凋亡是足細(xì)胞丟失的主要原因。至目前為止，引起足細(xì)胞凋亡的因素很多，但機(jī)制復(fù)雜，是當(dāng)前腎病學(xué)科的研究熱點(diǎn)。因此，探討足細(xì)胞凋亡機(jī)制及有效干預(yù)手段對(duì)尋求治療DN具有重大意義。近年來，RSV用于治療腎臟疾病越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。有研究證實(shí)在STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型DN中，RSV可顯著降低蛋白尿水平，改善腎臟病理損傷[6]。RSV可通過激活SIRT1/PGC-1α途徑，改善線粒體功能障礙，從而減輕醛固酮誘導(dǎo)的蛋白尿及足細(xì)胞損傷[7]。探討RSV對(duì)足細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及潛在分子學(xué)機(jī)制，為DN的防治研究提供了新方向。

本研究采用體外高糖孵育模擬糖尿病體內(nèi)環(huán)境，結(jié)果表明RSV可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，并呈量效關(guān)系，這可能是其可降低蛋白尿的機(jī)制之一。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RSV可顯著降低細(xì)胞內(nèi)及線粒體ROS的合成、提高線粒體膜電位、下調(diào)cleaved caspase 3及cleaved caspase 9的表達(dá)水平，提示RSV對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過抑制氧化應(yīng)激，改善線粒體功能障礙實(shí)現(xiàn)的。

足細(xì)胞作為一種終末分化細(xì)胞，對(duì)ROS異常敏感，高糖刺激時(shí)氧化和抗氧化系統(tǒng)的失衡及ROS產(chǎn)生過多是導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的主要機(jī)制之一[8-9]。ROS不僅可以直接損傷足細(xì)胞，還可激活NADPH氧化酶產(chǎn)生更多的ROS，從而形成惡性循環(huán)[10]。有學(xué)者更是提出在糖尿病早期，高糖即可通過ROS啟動(dòng)足細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)其從基底膜脫落，降低腎小球內(nèi)足細(xì)胞數(shù)量，出現(xiàn)蛋白尿[11]。以上研究均提示氧化應(yīng)激可能是DN中足細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一。本研究中，RSV干預(yù)可顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS生成，改善高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)了顯著的抗氧化作用。近年來，RSV的抗氧化作用日益成為腎臟病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，研究顯示RSV可顯著降低糖尿病大鼠腎組織中ROS及MDA水平，減少細(xì)胞凋亡[12]。在高糖刺激的系膜細(xì)胞中，RSV可激活SIRT1，減少高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)線粒體的損傷[13]。可見，RSV作為一種具有抗氧化作用的中藥單體，在轉(zhuǎn)化為公認(rèn)抗氧化劑發(fā)面具有巨大潛力。

線粒體是真核細(xì)胞能量供應(yīng)的最重要細(xì)胞器，通過氧化磷酸化途徑產(chǎn)生機(jī)體內(nèi)大部分ATP，同時(shí)它也是ROS生成的主要來源，亦是ROS的作用靶點(diǎn)[14-15]。ROS可損傷線粒體的酶類、脂類和核酸，進(jìn)一步導(dǎo)致ROS合成增加。同時(shí)，ROS還可對(duì)線粒體DNA產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致線粒體ATP合成減少、線粒體膜電位破壞等結(jié)構(gòu)和功能的改變，因此ROS增多也是線粒體功能障礙的表現(xiàn)之一。綜上，氧化應(yīng)激與線粒體功能密切相關(guān)，亦有研究顯示高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是由線粒體依賴的通路介導(dǎo)的。本研究發(fā)現(xiàn)RSV干預(yù)可顯著降低足細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS的生成，提高線粒體膜電位，改善線粒體功能障礙。線粒體功能障礙可引發(fā)內(nèi)源性的線粒體凋亡途徑，首先表現(xiàn)為線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔道的開放，進(jìn)一步引起線粒體膜去極化，凋亡前因子如細(xì)胞色素c釋放入胞漿，進(jìn)而激活caspase 3、caspase 9等細(xì)胞凋亡蛋白。本實(shí)驗(yàn)中，RSV可顯著降低cleaved caspase 3及cleaved caspase 9的表達(dá)水平，改善足細(xì)胞凋亡，提示RSV可通過改善線粒體功能障礙抑制內(nèi)源性的線粒體凋亡途徑。綜上所述，RSV可通過抑制氧化應(yīng)激，改善線粒體功能障礙抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。然而，RSV如何靶向降低ROS的生成、提高線粒體膜定位、抑制線粒體依賴性的凋亡途徑，值得更加深入的探索與研究。

研究結(jié)果表明RSV呈濃度依賴性的抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，其保護(hù)作用可能與抑制氧化應(yīng)激，改善線粒體功能障礙相關(guān)。以此推測(cè)RSV可用于預(yù)防足細(xì)胞損傷，在DN的防治方面具有廣大空間。當(dāng)然，這一推論還有待于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。