朱 濤，張吉桂

（1.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院消化內(nèi)科，恩施 445000；2.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院內(nèi)鏡中心，恩施 445000）

蘿卜硫素（SFN）主要提取于十字花科蔬菜中的一種異硫氰酸酯類活性物質(zhì)，包括西蘭花、花椰菜及甘藍(lán)菜等[1]。近年來較多的報道闡述了蘿卜硫素可以預(yù)防、延緩及逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生之前的病理改變，并且對抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖表現(xiàn)出較好的藥理作用[2-5]，也許會成為臨床上常用的抗腫瘤藥物。結(jié)腸癌是發(fā)生發(fā)展在結(jié)腸部位的一種常見消化道惡性腫瘤，其發(fā)生率在消化道惡性腫瘤中占據(jù)第3位[6]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌在中國的發(fā)病率和病死率每年呈上升趨勢，達(dá)到或超過了西方發(fā)達(dá)國家的水平[7]。研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路對腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及和化療敏感性起著重要的作用，并且結(jié)腸癌細(xì)胞中PI3K/Akt的異常激活參與了結(jié)腸癌的啟動[8-9]。然而，有報道闡述蘿卜硫素可以通過抑制PI3K/Akt信號通路活化而改善細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[10]，因此，筆者探討PI3K/Akt信號通路在蘿卜硫素誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞（HT-9）凋亡中的作用。

1 材料及方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-9（美國ATCC公司）；蘿卜硫素（上海寶曼生物科技有限公司，批號：4478-93-7，純度≥99%）；DMEM培養(yǎng)基及0.25%胰酶（上海谷歌生物有限公司）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號：110524）；CCK8增殖和毒性檢測試劑盒（江蘇碧云天生物科技研究所，批號：WH1175）；PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物有限公司，批號：KGA106）；BCA蛋白測定試劑盒（上海威奧生物科技有限公司，批號：WB0123）；SDS-PAGE試劑盒（武漢谷歌生物有限公司，批號：P1320）；兔抗人PI3K、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2 及 β-actin 等多克隆一抗（英國Abcam公司），HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（武漢谷歌生物科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 HT-9細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，包含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，然后置于37℃、5%CO2的恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底的90%左右時便可進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。然后取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板或6孔板，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的蘿卜硫素（10、20、40 mg/L）處理細(xì)胞，再繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.3 CCK8實驗檢測細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期的HT-9細(xì)胞制備成懸液，然后以1×104/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜后，吸盡舊培養(yǎng)基，然后加入含不同濃度蘿卜硫素（10、20、40 mg/L）的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育處理24、48、72 h后，除去板內(nèi)培養(yǎng)基，然后每孔加入含10 μL CCK8試劑的無血清培養(yǎng)再繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀于540 nm波長處檢測每孔的吸光度值。

1.4 IP染色觀察細(xì)胞凋亡情況 取對數(shù)生長期的HT-9細(xì)胞制備成懸液，然后以1×105/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜后，吸盡舊培養(yǎng)基，然后加入含不同濃度蘿卜硫素（10、20、40 mg/L）的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育處理24 h后，除去板內(nèi)培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞3次，加入不含EDTA的胰酶進(jìn)行消化收集細(xì)胞，再用PBS清洗細(xì)胞3次，5 000 r/min離心6 min，收集細(xì)胞。然后將細(xì)胞重懸后加入5 μL PI混勻，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western Blot檢測蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期的HT-9細(xì)胞制備成懸液，然后以1×105/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜后，吸盡舊培養(yǎng)基，然后加入含不同濃度蘿卜硫素（10、20、40 mg/L）的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育處理24 h后，收集細(xì)胞裂解，檢測蛋白濃度，然后每孔以50 μg蛋白量上樣進(jìn)行凝膠電泳分離，電壓設(shè)置為70 V；待分離完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，電流設(shè)定為275 mA、時間為70 min。接著將膜放入5%脫脂奶粉中封閉1 h，孵育一抗過夜，用TBST洗膜3次后室溫條件孵育對應(yīng)二抗1h，再次洗膜3次，便可進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析檢驗，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘿卜硫素抑制HT-9細(xì)胞增殖 不同劑量的蘿卜硫素作用HT-9細(xì)胞24、48、72 h后，用CCK8試劑對HT-9細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行評估。無論藥物作用細(xì)胞的時間有多久，HT-9細(xì)胞增殖抑制率相對于對照組均顯著升高（P<0.05）；而且隨著藥物劑量的升高，細(xì)胞增殖受到的抑制效果更為顯著，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。除此之外，還評價了蘿卜硫素作用不同時間后對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明隨著作用時間的延長，細(xì)胞的增殖抑制率明顯升高，組間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。見表1。

2.2 蘿卜硫素對HT-9細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響 不同劑量的蘿卜硫素作用HT-9細(xì)胞24 h后，采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行評估。隨著藥物劑量的升高，細(xì)胞凋亡率也隨之顯著上升，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。藥物組中細(xì)胞的凋亡率均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同劑量藥物組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，它們之間的細(xì)胞凋亡率均表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。蘿卜硫?qū)T-9細(xì)胞周期的影響，提示蘿卜硫素可以讓HT-9細(xì)胞停留在G0/G1期，誘導(dǎo)其凋亡。見圖1，表2，表3。

2.3 蘿卜硫素對凋亡蛋白的影響 不同劑量的蘿卜硫素作用HT-9細(xì)胞24 h后，提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果提示細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平隨著藥物劑量增加而顯著升高，與對照組比較差異均有統(tǒng)計意義（P＜0.05）；而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量則隨藥物劑量升高顯著降低，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；上述兩種蛋白的

表1 蘿卜硫素對HT-9細(xì)胞增殖的抑制作用（±s）Tab.1 Inhibitory effect of sulforaphane on the proliferation of HT-9 cells（±s）

表1 蘿卜硫素對HT-9細(xì)胞增殖的抑制作用（±s）Tab.1 Inhibitory effect of sulforaphane on the proliferation of HT-9 cells（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與 10 μg/mL 蘿卜硫素組比較，#P＜0.05；與 20 μg/mL 蘿卜硫素組比較，△P＜0.05；與藥物作用 24 h 組比較，◇P＜0.05；與藥物作用 48 h 組比較，□P＜0.05。

組別對照組 2.1±0.4 3.7±1.1 4.5±1.4 10 μg/mL 蘿卜硫素組 16.4±1.4* 23.5±0.7*◇ 29.4±1.6*◇□20 μg/mL 蘿卜硫素組 34.4±2.5*# 49.5±3.1*#◇ 66.1±3.8*#◇□40 μg/mL 蘿卜硫素組 52.1±3.8*#△ 72.3±4.2*#△◇ 86.9±5.9*#△◇□增殖抑制率（%）24 h 48 h 72 h

圖1 蘿卜硫素對HT-9細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of sulforaphane on the apoptosis of HT-9 cells

表2 蘿卜硫素對HT-9細(xì)胞凋亡率的影響（±s）Tab.2 Effect of sulforaphane on the apoptosis rates of HT-9 cells（±s）

表2 蘿卜硫素對HT-9細(xì)胞凋亡率的影響（±s）Tab.2 Effect of sulforaphane on the apoptosis rates of HT-9 cells（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與 10 μg/mL 蘿卜硫素組比較，#P＜0.05；與 20 μg/mL 蘿卜硫素組比較，△P＜0.05。

組別 凋亡率（%）對照組 2.34±0.62 10 mg/L蘿卜硫素組 14.67±1.95*20 mg/L蘿卜硫素組 27.95±2.53*#40 mg/L 蘿卜硫素組 35.60±3.75*#△

表3 蘿卜硫素對HT-9細(xì)胞周期的影響（±s）Tab.3 Effect of sulforaphane on the cell cycle of HT-9 cells（±s）

表3 蘿卜硫素對HT-9細(xì)胞周期的影響（±s）Tab.3 Effect of sulforaphane on the cell cycle of HT-9 cells（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別 G0/G1 G2/M S對照組 41.56±1.29 16.21±1.04 42.23±2.43 10 mg/L 蘿卜硫素組 47.04±1.94* 19.34±1.47 33.62±1.48 20 mg/L 蘿卜硫素組 56.43±1.52* 21.04±0.94 22.53±1.07 40 mg/L 蘿卜硫素組 63.41±2.47* 18.34±1.21 18.25±0.94

表達(dá)水平均呈現(xiàn)出藥物劑量依賴性。見圖2。

2.4 蘿卜硫素對PI3K/Akt信號通路的影響 不同劑量的蘿卜硫素作用HT-9細(xì)胞24 h后，提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行PI3K/Akt信號通路活化程度分析。Western Blot結(jié)果顯示PI3K表達(dá)水平及Akt的磷酸化水平均隨蘿卜硫素濃度升高而顯著降低，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示，蘿卜硫素可以通過抑制PI3K/Akt信號通路的活化，從而誘導(dǎo)HT-9細(xì)胞的凋亡。見圖3。

3 討論

早期報道蘿卜硫素能夠通過PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞凋亡和S期阻滯，可能成為一種新的抗腫瘤藥物[11]，其中還發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素還可以通過誘導(dǎo)Nrf2蛋白表達(dá)，抑制Keap-1蛋白表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素能夠阻滯人結(jié)腸癌HT-9細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞增殖率降低，其作用效果表現(xiàn)出明顯的時間、劑量依賴性。流式細(xì)胞術(shù)對HT-9細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素能夠顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并隨著藥物濃度升高而顯著增強(qiáng)，主要將細(xì)胞停留在G0/G1期。

圖2 蘿卜硫素對Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect of sulforaphane on the expression of Bax,Bcl-2 protein

圖3 蘿卜硫素對PI3K/Akt信號通路的影響Fig.3 Effect of sulforaphane on the PI3K/Akt signaling pathway

在腫瘤細(xì)胞生長、增殖及凋亡的重要病理環(huán)節(jié)過程中，PI3K/Akt信號通路的異常激活在腫瘤信號傳導(dǎo)過程中扮演著重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K蛋白的激活能讓耐藥腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感[12-13]，Akt在PI3K信號傳導(dǎo)中起著樞紐作用，其中Akt的磷酸化可以活化或者阻滯多條信號傳導(dǎo)，如Bcl-2/Bax、mTOR及Caspase-9等。其中Bcl-2/Bax通路蛋白是在細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中起著關(guān)鍵性的作用，也是Akt信號傳導(dǎo)的重要下游靶標(biāo)[14]。Bcl-2家族包括抗凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2）和促凋亡相關(guān)蛋白（如Bax）等，在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用，其中Bcl-2/Bax蛋白含量的平衡在細(xì)胞是否發(fā)生凋亡中起著決定性作用。p-Akt可以分布在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞核的細(xì)胞器內(nèi)，能夠和它的特異性底物發(fā)生相互作用，能夠調(diào)控Bcl-2/Bax蛋白的平衡，以達(dá)到控制細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖。目前，PI3K/Akt信號通路在較多的腫瘤細(xì)胞中均表現(xiàn)出異常激活，其中PI3K及p-Akt均高度表達(dá)。本實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素可以明顯降低PI3K及p-Akt水平，還抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并誘導(dǎo)了促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。于是，蘿卜硫素可以阻滯Akt的信號傳導(dǎo)，使Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)量出現(xiàn)失衡，活化凋亡信號，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，蘿卜硫素能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號通路的活化相關(guān)。

（收稿日期：2018-05-15）