歐陽(yáng)娟，薛松磊，徐 妍，沈 暉，崔恒宓

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

豐年蝦（Artemia salina）又稱鹵蟲(chóng)、豐年蟲(chóng)，是一種體長(zhǎng)為1～2 cm的小型甲殼類動(dòng)物，主要生活在高鹽度水域中，生活環(huán)境物種多樣性低，營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單（Browne等，2018）。其適應(yīng)能力、繁殖能力和休眠卵抗逆性強(qiáng)，孵化時(shí)間較短，只需18～30 h（Gajardo等，2012）便可孵化成無(wú)節(jié)幼蟲(chóng)。因?yàn)樨S年蝦無(wú)節(jié)幼蟲(chóng)體內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)常作為水產(chǎn)動(dòng)物苗種的開(kāi)口活餌料（黃旭雄，2007）。研究表明，作為水產(chǎn)動(dòng)物苗種的開(kāi)口活餌料能提高幼魚(yú)存活率（王衛(wèi)軍等，2017），還可以為水產(chǎn)養(yǎng)殖中傳染病治療研究提供工具（Torres等，2018）。

蝦卵孵化與溫度、鹽度、pH等因素有關(guān)（景素琴等，2016；李景等，2013；曾憲英等，2004），以往研究通常會(huì)對(duì)某種單獨(dú)孵化條件進(jìn)行探索，得出大致范圍，但對(duì)豐年蝦較優(yōu)的孵化方案研究較少。本文通過(guò)設(shè)計(jì)單因素和正交試驗(yàn)，研究溫度、鹽度、pH及孵化時(shí)間對(duì)豐年蝦孵化率的影響，最后得出較為準(zhǔn)確的孵化方案，旨在為優(yōu)化豐年蝦孵化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)用可孵化豐年蝦卵購(gòu)自廈門(mén)華普水產(chǎn)開(kāi)發(fā)有限公司。通過(guò)體視顯微鏡篩選高質(zhì)量豐年蝦蝦卵，準(zhǔn)確稱取2 g蝦卵，約為3.49×105個(gè)。

1.2 試驗(yàn)方法 溫度試驗(yàn)：設(shè)置5個(gè)溫度梯度，分別為 24、26、28、30、32℃。利用恒溫加熱器控制水溫，待水溫穩(wěn)定后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

pH試驗(yàn)：設(shè)置7個(gè)pH梯度，分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10。分別利用 NaOH、NaHCO3調(diào)節(jié)pH至相應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

鹽度試驗(yàn)：設(shè)置7個(gè)鹽度梯度，分別為5、10、15、20、25、30、35，分別利用海鹽調(diào)節(jié)鹽度。鹽度單位為g/L，以下均用‰表示，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

孵化時(shí)間試驗(yàn)：設(shè)置5個(gè)時(shí)間梯度，分別為20、22、24、26、28 h。從放入豐年蝦開(kāi)始孵化和停止孵化為時(shí)間間隔，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

通過(guò)單因素試驗(yàn)得出每個(gè)試驗(yàn)的最佳水平，選取最佳水平及其前后兩水平，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。

1.3 計(jì)算方法 豐年蝦孵化率公式如下

孵化率=n/N×100%；

式中，n1、n2、n3，分別代表 3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)中每毫升孵化液中豐年蝦無(wú)節(jié)幼蟲(chóng)個(gè)數(shù)。n為孵化出的豐年蝦無(wú)節(jié)幼蟲(chóng)平均數(shù)。N為豐年蝦總數(shù)目。1.4 數(shù)據(jù)處理 采用Pad Prism6作圖，Spss軟件分析數(shù)據(jù)。用正交試驗(yàn)軟件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“Mean±SD”表示。

2 結(jié)果

2.1 溫度對(duì)豐年蝦孵化率的影響 溫度為24～28℃時(shí)，豐年蝦孵化率隨溫度升高而升高；溫度為28～32℃時(shí)隨溫度升高而下降。當(dāng)溫度為28℃時(shí)孵化率最高，為（73±5.9）%。與溫度為28℃比較，其他各組孵化率均顯著降低，差異極顯著。

圖1 不同溫度對(duì)豐年蝦孵化率的影響

2.2 pH對(duì)豐年蝦孵化率的影響 pH為7.0～9.5時(shí)，豐年蝦孵化率隨pH的升高而升高；pH為9.5～10.0時(shí)則隨pH升高而下降。當(dāng)pH為9.5時(shí)孵化率最高，為（87±7.5）%。與pH為9.5比較，各個(gè)pH下顯著性標(biāo)記見(jiàn)圖2。

圖2 不同pH值對(duì)豐年蝦孵化率的影響

2.3 鹽度對(duì)豐年蝦孵化率的影響 鹽度為5‰～10‰時(shí)，豐年蝦孵化率隨鹽度升高而升高；鹽度為10‰～35‰時(shí)則隨鹽度升高而下降。當(dāng)鹽度為10‰時(shí)孵化率最高，為（86±3.8）%。與鹽度為10‰比較，各個(gè)pH下孵化率見(jiàn)圖3。

圖3 不同鹽度對(duì)豐年蝦孵化率的影響

2.4 孵化時(shí)間對(duì)豐年蝦孵化率的影響 時(shí)間為20～22 h時(shí)，豐年蝦孵化率隨時(shí)間升高而升高；時(shí)間為22～28 h時(shí)則隨鹽度升高而下降。當(dāng)時(shí)間為22 h時(shí)孵化率最高，為（85±4）%。與時(shí)間為22 h相比，其他各組孵化率均顯著降低，差異極顯著。

圖4 不同時(shí)間對(duì)豐年蝦孵化率的影響

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果 在豐年蝦孵化試驗(yàn)中，8號(hào)試驗(yàn)得到孵化率最大，為（85±5）%，此時(shí)四因素分別為溫度30℃、pH為9.5、鹽度為5‰、孵化時(shí)間為24 h。由表2可知，影響孵化率因素的主次順序依次為溫度和鹽度、時(shí)間、pH；溫度最佳水平為三水平，其他因素最佳水平均為二水平，此條件的試驗(yàn)方案在正交表的9次試驗(yàn)中并沒(méi)有出現(xiàn)。通過(guò)做補(bǔ)充試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豐年蝦孵化率達(dá)（89±4）%，大于正交試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明利用正交試驗(yàn)優(yōu)化豐年蝦孵化方法有效可行。生產(chǎn)中為了得到最大孵化率，主要影響因素應(yīng)取最佳水平，而次要因素可根據(jù)成本、時(shí)間、收益等方面的統(tǒng)籌考慮選取適當(dāng)?shù)乃健?/p>

表1 四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

表2 四因素三水平試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 溫度 溫度是影響豐年蝦孵化的重要因素之一，不僅影響其孵化率，而且對(duì)其孵化時(shí)間、存活率也存在影響。已有文獻(xiàn)報(bào)道（曾憲英等，2004），在0～35℃鹵蟲(chóng)卵（豐年蝦）均能進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育。試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)批次的豐年蝦孵化的最適溫度為30℃，這與潘正軍等（2007）、劉鳳岐等（2001）的研究結(jié)果存在差異。推測(cè)可能是豐年蝦品系之間的差異。

3.2 pH pH對(duì)豐年蝦孵化率存在一定影響，主要是通過(guò)影響豐年蝦體內(nèi)的孵化酶活性影響豐年蝦的孵化率。有研究報(bào)道，pH為8～9時(shí)，豐年蝦孵化酶活性最強(qiáng)（曾憲英等，2014）。酸性水質(zhì)通常不利于蝦殼脫落，因此孵化率較低。劉愛(ài)英等（2001）研究表明，pH為7.5～9.5對(duì)鹵蟲(chóng)孵化率影響較大。本試驗(yàn)批次的豐年蝦孵化最適pH為9.5?？赡苁且?yàn)樵趯?shí)際孵化過(guò)程中，隨著孵化出的豐年蝦幼蟲(chóng)增多，水體pH逐漸下降，孵化時(shí)所調(diào)pH略高于孵化酶的最適pH，有利于對(duì)水體起調(diào)節(jié)作用，穩(wěn)定pH，提高孵化率。在實(shí)際生產(chǎn)中，需要對(duì)當(dāng)?shù)貙?shí)際水體的pH進(jìn)行考察，如果孵化所需要的pH存在差異，則可以跟據(jù)當(dāng)?shù)貙?shí)際情況調(diào)節(jié)pH，以提高孵化率。

3.3 鹽度 豐年蝦孵化過(guò)程中，鹽度的影響較大。在實(shí)際生產(chǎn)中，豐年蝦對(duì)鹽度的耐受性較強(qiáng)（潘正軍等，2017），但在高鹽或低鹽的環(huán)境下，豐年蝦孵化率會(huì)下降。鹽度主要是通過(guò)改變環(huán)境中的滲透壓對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)生影響（Clegg等，2002；Dana等1986），當(dāng)環(huán)境中滲透壓超出了其調(diào)節(jié)范圍，導(dǎo)致孵化率降低（杜學(xué)芳，2013），或者是影響豐年蝦體內(nèi)血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)（Trotman等，2018），使得豐年蝦細(xì)胞呼吸異常，降低孵化率。豐年蝦孵化鹽度的耐受范圍可能與豐年蝦種群分布（Castro等，2000）、地區(qū)（Velasco等，2018）等有關(guān)。本試驗(yàn)批次的豐年蝦孵化的最適鹽度為10‰。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中需要進(jìn)行實(shí)地考察，如果實(shí)際鹽度與水產(chǎn)動(dòng)物生活鹽度相差較大則應(yīng)對(duì)孵化場(chǎng)鹽度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，提高孵化率。

3.4 孵化時(shí)間 孵化時(shí)間對(duì)豐年蝦孵化率具有一定影響。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，孵化時(shí)間主要和其他因素共同影響豐年蝦孵化率。有研究報(bào)道（劉愛(ài)英等，2000），當(dāng)孵化時(shí)間為30 h，綜合考慮其他因素得出豐年蝦孵化率較高。本試驗(yàn)批次的豐年蝦孵化的最適孵化時(shí)間為30 h，各個(gè)孵化時(shí)間之間的差異不顯著。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，應(yīng)同時(shí)考慮孵化時(shí)間與其他孵化因素。

4 結(jié)論

綜上所述，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，溫度、pH、鹽度及孵化時(shí)間對(duì)豐年蝦孵化率均存在顯著性影響。根據(jù)正交結(jié)果可知，環(huán)境因素中，溫度和鹽度對(duì)豐年蝦孵化率的影響大于pH和孵化時(shí)間，且4種因素彼此會(huì)相互影響。綜合4種因素考慮，最佳條件為溫度30℃、pH9.5、鹽度10‰、孵化時(shí)間22 h。在實(shí)際生產(chǎn)中可以首先考慮溫度和鹽度兩個(gè)因素，再結(jié)合當(dāng)?shù)貙?shí)際情況包括孵化地的酸堿性、晝夜溫差變化等進(jìn)行孵化條件的調(diào)整，從而獲得最高孵化率。