郭睿

摘 要：L-門冬酰胺酶（Asparaginase）是一種被收錄進《中國藥典》2015年版用于治療小兒急性白血病的藥物。在《中國藥典》2015年版中用于檢測其效價的是比色法。但出現(xiàn)用反相高效液相色譜法檢測效價的方法，通過試驗發(fā)現(xiàn)反相高效液相色譜法不能用于門冬酰胺酶效價檢測。

關(guān)鍵詞：L-門冬酰胺酶;效價檢測

L-門冬酰胺酶（Asparaginase）是一種被收錄進《中國藥典》2015年版[1]用于治療臨床主要用于急性淋巴細胞性白血病，也用于急性粒細胞性白血病，急性單核細胞性白血病和惡性淋巴瘤的藥物。因淋巴腫瘤細胞不能自身合成對生長必要的氨基酸門冬酰胺，必須依賴宿主供給，而門冬酰胺酶能使門冬酰胺水解，使細胞缺乏門冬酰胺，從而抑制其生長的作用。正常細胞由于能夠自主合成門冬酰胺，故受影響較少。

在《中國藥典》2015年版中，對于L-門冬酰胺酶的活性測定方法為終點法，即是考察一定量的蛋白酶在一定時間內(nèi)水解酰胺基產(chǎn)生的游離銨離子的量，再將碘化汞鉀與氨反應(yīng)生成黃色溶液用比色法測定，根據(jù)氨量計算酶的效價。并規(guī)定每1 mg蛋白含門冬酰胺酶的活力不得低于250單位。我公司的一家印度客戶則提供另一種利用反相高效液相色譜法來測定門冬酰胺酶的效價。本文主要對這兩種方法進行分析研究，探索L-門冬酰胺酶效價更高效、更準確的測定方法。

1 《中國藥典》2015年版中門冬酰胺酶效價檢測方法

1.1 試驗材料與方法

1.1.1 試驗儀器

紫外-可見分光光度計、恒溫水浴鍋、105℃鼓風(fēng)干燥箱、電子天平（感量為0.1mg）、秒表、容量瓶、吸量管、進樣器。

1.1.2 試劑與藥品

試劑：0.1mol/L磷酸氫二鈉、0.1mol/L磷酸二氫鈉、25%三氯醋酸溶液、0.0015mol/L硫酸銨溶液;

藥品：門冬酰胺酶（常州千紅生化制藥股份有限公司，批號：47170531008C）。

1.1.3 測試方法與結(jié)果

①取試管4支（14cm×1.2cm），各加入用上述磷酸鹽緩沖液配制的 0.33%門冬酰胺溶液1.9mL，于37℃恒溫水浴中預(yù)熱3分鐘;②分別于第1管（to）中加入25%三氯醋酸溶液0.5mL，第2、3、4管（t）中各精密加入供試品溶液0.1m1，置37℃水浴中，準確反應(yīng)15分鐘，立即于第1管（to）中精密加入供試品溶液0.1mL，第2、3、4管（t）中各加入25% 三氯醋酸溶液0.5m1，搖勻，分別作為空白反應(yīng)液（to）和反應(yīng)液（t）;③精密量取to、t和對照品溶液各0.5mL置試管中，各加水7.0mL及碘化汞鉀溶液1.0mL，混勻;另取試管一支，加水7.5mL及碘化汞鉀溶液1.0m1作為空白對照管，室溫放置15分鐘，照紫外-可見分光光度法在450nm的波長處，分別測定吸光度A0、At和As，以At的平均值;④結(jié)果計算：a.以平均值分別求得標準品和供試品的ΔA值;b.按下式計算：

式中：5為反應(yīng)常數(shù);F為對照品溶液濃度的校正值。

效價單位定義：在上述條件下，一個門冬酰胺酶單位相當于每分鐘分解門冬酰胺產(chǎn)生1μ mol氨所需的酶量。

檢測結(jié)果為：129.6U/mg

第一人檢測結(jié)果：

2 反相高效液相色譜法測定門冬酰胺酶效價方法

2.1 試驗材料與方法

2.1.1 試驗儀器

高效液相色譜儀。

2.1.2 試劑與藥品

試劑：甲酸溶液、乙腈溶液;

藥品：門冬酰胺酶（常州千紅生化制藥股份有限公司，批號：47170531008C），門冬酰胺酶標準品（中國食品藥品檢定研究所，批號：JMRT-J94X）。

2.1.3 測定方法與結(jié)果

2.1.3.1 色譜條件

流動相：0.1%甲酸溶液和0.1%乙腈溶液，比例為7：3;

色譜柱：4.6mm×15cm色譜柱（Hamilton色譜柱）;

檢測波長：278nm;

進樣量：50μl.;

流速：0.4mL/min;

柱溫：室溫。

2.1.3.2 溶液準備

標準品溶液：稱取25mg門冬酰胺酶標準品，于50mL容量瓶中，加20-30mL水并定容至50mL，得500mcg/mL溶液。

供試品溶液：稱取25mg門冬酰胺酶供試品，于50mL容量瓶中，加20-30mL水并定容至50mL，得500mcg/mL溶液。

注：①拖尾因子不得超過2.0;②重復(fù)進樣檢測峰面積RSD不得超過2.0%

2.1.3.3 結(jié)果計算：

檢測結(jié)果：雙人雙份都無檢出。

3 結(jié)果分析與討論

因分析靈敏度高、分析時間短，現(xiàn)在越來越多的將反相高效液相色譜法用于化藥的鑒別和純度檢測，但用于藥品效價等活性成分的檢測卻很少。從此次試驗也可看出，同一批門冬酰胺酶分別用《中國藥典》2015年版和印度客戶提供的反相高效液相色譜法，前一種方法可以很順利檢測出此批產(chǎn)品效價值，但后一種方法無法檢測出結(jié)果。分析后認為，門冬酰胺酶是一種生物大分子，一般不耐受高濃度的有機溶劑，因此在檢測流動相中會引起門冬酰胺酶高級結(jié)構(gòu)的變化，從而導(dǎo)致活性的喪失，分子結(jié)構(gòu)被降解，而無法被檢測出。目前反相高效液相色譜法不能用于門冬酰胺酶效價檢測。隨著藥物分析理論和藥物檢測儀器的發(fā)展，更高效、更便捷的檢測方法定會出現(xiàn)，并迅速予以推廣運用。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.