徐紅華 謝明明 丁 瑞 馬金玉 高子雯 關 琛

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

乳清濃縮蛋白(WPC)在特殊條件下可以自組裝形成纖維狀聚合物[1-3]。由于乳蛋白納米纖維具有特殊的功能性質(zhì)(如凝膠性[4]、增稠特性[5]、穩(wěn)定的乳化性[6-7]與泡沫穩(wěn)定性[8])，近年來在食品行業(yè)中應用廣泛。這種纖維狀聚合物的形成過程可分為滯后期、生長期和穩(wěn)定期[9]。纖維形成機理主要為二次成核理論，即初級成核與二次成核。初級成核是在滯后期蛋白質(zhì)單體發(fā)生聚合形成穩(wěn)定的均相核結構，均相核具有在纖維形成過程中最高的自由能；二次成核是指單體在均相核的表面有序排列，從而形成成熟纖維的過程[10-14]。研究發(fā)現(xiàn)在乳清分離蛋白形成纖維過程中加入二次核(成熟纖維)，滯后期時間縮短，加速纖維的形成[15]，均相核誘導蛋白形成纖維的研究報道較少。Ca2+會影響蛋白質(zhì)纖維自發(fā)形成的聚合結構，LOVEDAY等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白在形成纖維過程中添加一定的CaCl2，會促進纖維的形成，縮短滯后時間，但纖維的形態(tài)發(fā)生了變化，由長、細、半柔性變?yōu)槎绦?、彎曲。但是，目前的研究主要集中在CaCl2對WPC自發(fā)形成纖維的影響方面，鮮有核誘導方面的報道。本文通過比較添加CaCl2與未添加CaCl2對WPC自發(fā)形成的纖維以及均相核/二次核誘導WPC在聚合過程中硬度、黏度以及聚合率的差異，探討CaCl2對核誘導WPC聚合能力的影響，以期為改善乳清濃縮蛋白的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1主要材料

乳清濃縮蛋白WPC-80，美國HILMAR公司；CaCl2，純度99.99%，阿拉丁公司；硫黃素 T，Sigma公司；其他化學試劑均為分析純。

1.1.2主要儀器

CP153型電子精密天平，奧豪斯儀器有限公司；DELTA320型pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；3-18K型離心機，Sigma公司；KDN-102C型半自動定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；HHW型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州丹瑞實驗儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)流變儀，英國馬爾文公司；TA-XT2 PLUS型物性測定儀，英國STABLE MICRO SYSTEM公司；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡，日本日立公司；F-4500型熒光分光光度計，日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品的制備

乳清濃縮蛋白自發(fā)形成纖維加鈣(WPC自發(fā)+鈣)：參照LOVEDAY等[18]的方法略有改動，將5.00 g WPC溶于去離子水中，用6 mol/L HCl調(diào)pH值為2.0，定容至100 mL。19 000g、4℃下離心20 min，取中層清液，利用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，用pH值2.0的去離子水(6 mol/L HCl調(diào)去離子水至pH值2.0)稀釋至3.0%。添加0.75 mol/L的CaCl2溶液，蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.8%，CaCl2終濃度為50 mmol/L。90℃水浴加熱，并于4℃冰箱保存。

乳清濃縮蛋白自發(fā)形成纖維(WPC自發(fā))：上述3.0%蛋白溶液，添加與CaCl2相同體積的pH值2.0去離子水，蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.8%。90℃水浴加熱，并于4℃冰箱保存。

均相核誘導乳清濃縮蛋白形成纖維加鈣(均相核誘導WPC+鈣)：3.0%的WPC，90℃下加熱2 h形成均相核[19-20]。均相核與3.0% WPC溶液以質(zhì)量比1∶3混勻，蛋白質(zhì)量分數(shù)為3.0%(pH值2.0)。添加0.75mol/L的CaCl2溶液，蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.8%，CaCl2終濃度為50 mmol/L。90℃水浴加熱，并于4℃冰箱保存。

均相核誘導乳清濃縮蛋白形成纖維(均相核誘導WPC)：3.0%的均相核WPC混合液，添加與CaCl2相同體積的pH值2.0去離子水，蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.8%。90℃水浴加熱，并于4℃冰箱保存。

二次核誘導乳清濃縮蛋白形成纖維加鈣(二次核誘導WPC+鈣)：3.0%的WPC，90℃下加熱10 h形成成熟纖維即二次核。二次核與3.0% WPC溶液以質(zhì)量比1∶3混勻，蛋白質(zhì)量分數(shù)為3.0%(pH值2.0)。添加0.75 mol/L的CaCl2溶液，蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.8%，CaCl2終濃度為50 mmol/L。90℃水浴加熱，并于4℃冰箱保存。

二次核誘導乳清濃縮蛋白形成纖維(二次核誘導WPC)：3.0%的二次核WPC混合液，添加與CaCl2相同體積的pH值2.0去離子水，蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.8%。90℃水浴加熱，并于4℃冰箱保存。

1.2.2質(zhì)構特性

將pH值2.0的3.0% WPC、均相核、二次核與11.0% pH值2.0的WPC溶液以體積比1∶1混勻，使其蛋白質(zhì)量分數(shù)為7.0%?；旌先芤杭尤?.75 mol/L CaCl2，蛋白質(zhì)量分數(shù)為6.53%，CaCl2終濃度為50 mmol/L，于燒杯中90℃水浴加熱5 h。對照樣為蛋白質(zhì)量分數(shù)7.0%的混合液，加入與CaCl2相同體積的pH值2.0去離子水,蛋白質(zhì)量分數(shù)為6.53%。放置4℃冰箱12 h，次日取出恢復至室溫(20℃)。采用質(zhì)構剖面分析方法(Texture profile analyse, TPA)測定樣品的硬度、膠粘性指數(shù)、彈性指數(shù)以及咀嚼性指數(shù)，參數(shù)設定為：測試前速度1 mm/s，測試速度1.7 mm/s，測試后速度2 mm/s，下壓距離10 mm，引發(fā)力5 N，探頭型號A-BE-D35[21]。

加鈣樣品較對照樣硬度增加量為

N=NCa-N0

(1)

式中N——硬度增加量，g

NCa——加鈣樣品硬度，g

N0——對照樣硬度，g

加鈣樣品較對照樣膠粘性指數(shù)增加量為

A=ACa-A0

(2)

式中A——膠粘性指數(shù)增加量

ACa——加鈣樣品膠粘性指數(shù)

A0——對照樣膠粘性指數(shù)

1.2.3表觀黏度

1.2.1節(jié)中的樣品于90℃水浴加熱0、1、2、3、4、5、7、10 h，使用旋轉(zhuǎn)流變儀測定樣品的黏度。選擇直徑60 mm的平行板，板間距150 nm，剪切速率變化范圍為0.01～100 s-1，用一次性膠頭滴管吸取2 mL溶液，使樣品均勻分布于底部平板上[22],在剪切速率為10 s-1時取值。

加鈣樣品較對照樣黏度的增加量為

B=BCa-B0

(3)

式中B——加熱10 h的黏度增加量，Pa·s

BCa——加鈣樣品在加熱10 h的黏度，Pa·s

B0——對照樣在加熱10 h的黏度，Pa·s

1.2.4蛋白聚合率

1.2.1節(jié)中的樣品于90℃水浴加熱0、2、5 h，取20 mL樣液于50 mL離心管中，15 000g、4℃離心30 min，取上層清液，利用凱氏定氮法測定蛋白含量，計算公式為

C=1-Ct/CWPC0h

(4)

式中C——蛋白聚合率

CWPC0h——WPC自發(fā)加熱0 h的蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL

Ct——樣品加熱t(yī)時的蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL

1.2.5Th T熒光分析

1.2.1節(jié)中的樣品于90℃水浴加熱，每隔1 h取樣(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)。用含有0.2 mol/L的NaCl、0.01 mol/L的磷酸緩沖液(pH值7.0)配制800 mg/L的甲硫磺素T(Th T)的溶液。用水系0.22 μm濾膜過濾，濾液即為Th T儲備液。放置于棕色瓶中并于4℃冰箱避光保存。測定時將Th T儲備液用含有0.2 mol/L的NaCl、0.01 mol/L的磷酸緩沖液(pH值7.0)稀釋50倍，得到Th T工作液；取800 μL樣品加入10 mL的Th T工作液中，旋渦震蕩1 min后，于熒光分光光度計下比色。設定參數(shù)為：激發(fā)波長460 nm，發(fā)射波長490 nm，狹縫寬度5 nm和10 nm，測定不同加熱時間下樣品的熒光強度[23]。

1.2.6透射電鏡

1.2.1節(jié)中的樣品于90℃下加熱5 h，在4℃冰箱中保存12 h，取出后放至室溫。用超純水將樣品稀釋至1 mg/mL，取稀釋液滴于透射電鏡專用銅網(wǎng)上吸附20 min，用濾紙吸除多余液體，在室溫下干燥10 min，在80 kV電壓下觀察樣品的微觀結構[24]。

1.2.7數(shù)據(jù)處理分析

試驗數(shù)據(jù)采用SigmaPlot 10進行制圖和IBM SPSS Statistics v 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行ANOVA方差分析，檢驗差異顯著性(P<0.05)。數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示(n=3)。

2 結果與討論

2.1 凝膠質(zhì)構特性

結果如表1所示，未加鈣樣品其硬度與膠粘性均為核誘導WPC高于其自發(fā)聚合，并且二次核誘導略高于均相核誘導。CaCl2的加入可以明顯改善WPC樣品的凝膠質(zhì)構，但核誘導的提高幅度更大，從CaCl2添加前后WPC凝膠硬度的提升差值可以看出(圖1)，核誘導WPC分別是其自發(fā)聚合的1.661倍(均相核誘導)和1.821倍(二次核誘導)；膠粘性提升量分別是其自發(fā)聚合的2.544倍(均相核誘導)和2.129倍(二次核誘導)。上述結果可以發(fā)現(xiàn)，相對WPC自發(fā)聚合，CaCl2的加入對核誘導WPC聚合的影響更大。

表1 凝膠質(zhì)構特性Tab.1 Textural properties of different samples

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 表觀黏度

纖維形成過程中Ca2+的影響也存在很大差異，Ca2+在自發(fā)與核誘導2種不同形成方式中的作用也有很大不同。在形成過程中，黏度均呈上升趨勢。核誘導WPC形成的纖維聚合物其黏度高于WPC自發(fā)聚合，同時，添加CaCl2的樣品其黏度較對應的未添加CaCl2樣品均有升高，在前2 h的滯后期差異不大，隨著熱聚合的持續(xù)，Ca2+的影響程度增大(圖2a)；在形成方式中，Ca2+在自發(fā)與核誘導中的作用有很大不同，添加CaCl2后對核誘導聚合的改善幅度更大，均相核誘導WPC與二次核誘導WPC其黏度增加量分別是WPC自發(fā)黏度增加量的2.261與2.479倍(圖2b)。

圖1 WPC自發(fā)、均相核誘導WPC、二次核誘導WPC添加CaCl2后纖維凝膠硬度與膠粘性的變化Fig.1 Changes of hardness and gumminess by adding CaCl2 to WPC spontaneous, homogeneous nucleation induced WPC and secondary nucleation induced WPC

圖2 WPC自發(fā)、均相核誘導WPC、二次核誘導WPC添加CaCl2后形成纖維的黏度變化Fig.2 Changes of viscosity by adding CaCl2 to WPC spontaneous, homogeneous nucleation induced WPC and secondary nucleation induced WPC

表明CaCl2的加入對核誘導WPC熱聚合的提高幅度更大。

2.3 蛋白聚合率

通過聚合率可從側面研究蛋白質(zhì)的聚合能力。由圖3可知，隨著加熱時間延長，不同樣品的聚合率均有上升，這表明延長熱處理時間會促進蛋白質(zhì)之間聚合形成大分子聚合物。且核誘導WPC形成的蛋白聚合率高于WPC自發(fā)聚合。樣品添加CaCl2后其聚合率明顯提高，但是，在纖維形成的不同時期Ca2+的影響程度不同，未經(jīng)過熱處理(0 h)Ca2+的混入就可以提高聚合程度；隨著熱處理的進行，在纖維形成滯后期(2 h)Ca2+的混入可以較大幅度提高其聚合程度；生長期(5 h)Ca2+的影響程度降低，聚合率差值減小。

圖3 WPC自發(fā)、均相核誘導WPC、二次核誘導WPC添加CaCl2后形成的纖維在熱處理過程中聚合率的變化Fig.3 Changes of polymerization by adding CaCl2to WPC spontaneous, homogeneous nucleation induced WPC and secondary nucleation induced WPC

2.4 透射電鏡

通過透射電鏡觀察添加CaCl2對纖維微觀形態(tài)的影響。CaCl2的加入明顯改變纖維的形態(tài)，由細長半柔性的纖維(圖4a、4b、4c)變?yōu)槎绦澢鷪F簇聚集狀(圖4d、4e、4f)，表明添加50 mmol/L CaCl2對WPC的聚合有促進作用。核誘導形成的纖維數(shù)量較WPC自發(fā)形成的纖維多。對于自發(fā)與核誘導兩種纖維形成方式，加鈣WPC自發(fā)是獨立的纖維團簇聚集體而核誘導則是纖維團簇聚集體之間相連，CaCl2對核誘導形成的纖維聚合影響更大。

圖4 WPC自發(fā)、均相核、二次核誘導WPC添加CaCl2后加熱5 h形成的纖維透射電鏡圖Fig.4 Transmission electron micrographs of different samples heated for 5 h at 90℃ and pH value of 2.0

2.5 Th T熒光分析

Th T是一種熒光染料，可以與纖維的β-折疊結合，間接反映纖維的產(chǎn)量[8]。均相核與二次核誘導WPC形成的纖維其熒光強度較WPC自發(fā)聚合高(圖5)，表明核誘導較WPC自發(fā)形成纖維數(shù)量多?；烊隒a2+后在纖維形成的不同時期存在不同程度的影響。在滯后期(0～2 h)添加CaCl2的WPC自發(fā)與均相核誘導較對照樣熒光強度高，表明CaCl2在其滯后期促進纖維的形成，但在生長期與穩(wěn)定期熒光強度較對照樣低。二次核誘導WPC在加熱0～1 h，添加CaCl2的樣品與對照樣其熒光強度相近，從2 h開始，添加CaCl2的二次核誘導WPC其熒光強度較對照樣低。由此可推測，CaCl2并沒有影響纖維核結構的形成，但會促進隨后的聚合。纖維聚合在一起，Th T無法充分地與聚合纖維結合[25]，從而影響了熒光強度的結果。

圖5 WPC自發(fā)、均相核誘導WPC、二次核誘導WPC添加CaCl2后熱處理過程中Th T熒光強度的變化Fig.5 Changes of Th T fluorescence intensity by adding CaCl2 to WPC spontaneous, homogeneous nucleation induced WPC and secondary nucleation induced WPC

3 結論

(1)CaCl2會提高纖維體系的黏度、硬度與聚合率，并且CaCl2對核誘導形成的纖維影響更大。

(2)CaCl2的加入對纖維的形態(tài)有影響，使纖維由細長直鏈變?yōu)閺澢奂臓顟B(tài)，促進纖維之間的聚合，并且對核誘導的纖維影響更大。

(3)在加熱初期，添加CaCl2對WPC自發(fā)與均相核誘導WPC形成纖維有促進作用。在加熱后期，加鈣樣品的熒光強度較未加鈣樣品低。