張秋菊 ，李能蓮，馬亞偉，劉 靚，侯 茜，李亞玲

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 2013級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)B班， 甘肅 蘭州 730000)

大黃是一味主要的破堅攻邪中藥，瀉下、破積、行瘀的功效強悍，因此被稱為“將軍”。惡性腫瘤大多有氣滯郁結(jié)、痰濕凝滯等病理因素，遷延日久而凝聚成腫塊。據(jù)“堅者削之，留者攻之，結(jié)者散之，客者除之”的治療原則，大黃常被作為攻邪藥來治療腫瘤，療效顯著。低氧是人體有形之瘤微環(huán)境的一個最顯著特點，絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞可耐受缺氧而存活，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor，HIF-1α) 就是啟動這一過程的關(guān)鍵分子。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是上皮細(xì)胞連接中最主要的黏附分子，被認(rèn)為是HIF-1α下游的靶基因。HIF-1α和E-cadherin可共同影響腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移[1]。本研究通過大黃的有效成分大黃素(emodin)干預(yù)胃癌SGC7901細(xì)胞來探討大黃素在低氧環(huán)境中對腫瘤細(xì)胞增殖及HIF-1α和E-cadherin的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌SGC7901細(xì)胞株由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合實驗室饋贈。將SGC7901細(xì)胞株用加入體積分?jǐn)?shù)100 mL/L的胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)100 mg /L青、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，放置于37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱，常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期SGC7901細(xì)胞，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5 g/L的胰酶消化后，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、10 mL/L O2、940 mL/L N2低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試 劑

大黃素(純度﹥98%)、MTT試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)，均購自北京索萊寶科技有限公司，批號依次為S90044，M8180，8370；鼠抗人E-cadherin單克隆抗體，購自北京中杉金橋生物有限公司，批號ZM-0092；鼠抗人HIF-1α多克隆抗體，購自于Immunoway公司，批號B3301。

1.3 分組與處理

實驗分空白對照組(含DMSO的培養(yǎng)基)和實驗組(大黃素分別為10，20，40，80，160 μmol/L)，共6組。大黃素用DMSO溶解稀釋后，用體積分?jǐn)?shù)100 mL/L 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液分別稀釋為10，20，40，80，160 μmol/L，待用。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 胃癌SGC7901細(xì)胞增殖情況

以 MTT法檢測大黃素對胃癌SGC7901細(xì)胞增殖的影響。取對數(shù)生長期SGC7901細(xì)胞，以培養(yǎng)液稀釋為終濃度為1×105/mL 的單細(xì)胞懸液，以每孔100 μL 加入96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、10 mL/L O2、940 mL/L N2的低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后實驗組加入不同濃度的大黃素。每組設(shè)5個重復(fù)孔，繼續(xù)分別孵育12，24，36，48 h。實驗結(jié)束前4 h加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 g/L的 MTT溶液20 μL ，振蕩后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，吸去上清，加入100 μL DMSO振蕩溶解10 min，空白對照調(diào)零，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm波長下各孔OD值。計算細(xì)胞抑制率：抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4.2 E-cadherin和HIF-1α在胃癌SGC7901細(xì)胞中的表達(dá)

免疫組化檢測E-cadherin和HIF-1α在細(xì)胞中的表達(dá)。蓋玻片泡酸、高壓滅菌后，平放于12孔培養(yǎng)板底部；取對數(shù)生長期胃癌SGC7901細(xì)胞，以培養(yǎng)液稀釋為終濃度為1×105/mL的單細(xì)胞懸液；每孔加入2 mL；置于37 ℃、10 mL/L O2、940 mL/L N2低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h細(xì)胞貼壁后，換液。根據(jù)MTT結(jié)果，選取大黃素10，40，80 μmol/L 3個梯度組，每組4個重復(fù)孔，設(shè)空白組，低氧孵育36 h。終止培養(yǎng)，以100 g/L 多聚甲醛固定，常規(guī)免疫組織化學(xué)染色法分別標(biāo)記E-cadherin和HIF-1α。結(jié)果判定：E-cadherin表達(dá)在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上，HIF-1α表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上，呈棕黃色顆粒，在不同部位均一彌漫性分布。按染色強度[2]分為3級：淺黃色為(+)，棕黃色為(++)，棕褐色為(+++)。

1.4.3 胃癌SGC7901細(xì)胞形態(tài)變化

倒置顯微鏡下，不同倍數(shù)各取5個視野，觀察大黃素對SGC7901細(xì)胞形態(tài)的影響。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同時間、不同濃度大黃素對胃癌SGC7901細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示：大黃素可明顯抑制低氧環(huán)境中SGC7901細(xì)胞的增殖，抑制率與濃度、時間呈成正相關(guān)。見表1和圖1。

表1 不同時間、不同濃度大黃素對胃癌SGC7901細(xì)胞的影響

組別12 h24 h36 h48 h空白組0.058 6±0.017 00.058 4±0.013 90.074 4±0.032 40.061 2±0.017 9大黃素10 μmol·L-1組0.436 0±0.057 40.433 6±0.017 70.482 6±0.068 20.495 2±0.035 6大黃素20 μmol·L-1組0.362 2±0.066 50.362 2±0.045 20.406 8±0.055 20.432 8±0.013 7大黃素40 μmol·L-1組0.321 4±0.024 10.308 6±0.046 50.324 8±0.037 80.268 4±0.041 1大黃素80 μmol·L-1組0.275 4±0.036 80.236 8±0.031 00.233 4±0.041 60.214 8±0.057 3大黃素160 μmol·L-1組0.241 4±0.023 30.177 6±0.026 20.186 8±0.024 50.145 2±0.033 5

圖1 胃癌SGC7901細(xì)胞抑制率與大黃素濃度、時間的關(guān)系

2.2 不同濃度大黃素對胃癌SGC7901細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡觀察不同濃度大黃素作用36 h后SGC7901細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)的變化。SGC7901細(xì)胞隨著大黃素濃度的增加，細(xì)胞數(shù)目明顯不斷減少；細(xì)胞形態(tài)由原來的多邊形逐漸變成小圓形；細(xì)胞與細(xì)胞之間的距離增大，連接消失，但細(xì)胞表面的突起逐漸變得粗大、延長。當(dāng)大黃素濃度達(dá)到160 μmol/L時，絕大多數(shù)細(xì)胞變圓變亮，懸浮死亡。見圖2。

黑色箭頭所示為細(xì)胞間連接，白色箭頭所示為細(xì)胞突觸圖2 不同濃度大黃素干預(yù)36 h后的SGC7901細(xì)胞(×40)

2.3 不同濃度大黃素對SGC7901細(xì)胞中E-cadherin和HIF-1α表達(dá)的影響

E-cadherin和HIF-1α在SGC7901細(xì)胞中呈現(xiàn)不同的表達(dá)強度，應(yīng)用Spearman等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：E-cadherin的表達(dá)與大黃素的濃度呈正相關(guān)(r=0.816，P=0.001<0.05)，而HIF-1α的表達(dá)與大黃素的濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.646，P=0.023<0.05)。見圖3和表2。

圖3 大黃素濃度為80 μmol/L時，HIF-1α

組別nHIF-1α++++++E-cadherin++++++大黃素20 μmol·L-1組4112040大黃素40 μmol·L-1組4031022大黃素80 μmol·L-1組4400004

3 討 論

大黃素的化學(xué)名稱為 1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌，是中藥大黃的有效成分，也是分布最廣泛的一種蒽醌類物質(zhì)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，大黃素有明顯的抗腫瘤作用，但是作用機制仍有爭議[3]。HIF-1α是缺氧誘導(dǎo)因子的最主要亞型，與腫瘤細(xì)胞的能量代謝、血管生成、細(xì)胞增殖和凋亡等有密切關(guān)系。目前,HIF-1α被認(rèn)為是腫瘤治療的潛在靶點，相應(yīng)的藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段。本實驗?zāi)M了實體瘤的低氧微環(huán)境，采用不同濃度的大黃素干預(yù)胃癌SGC7901細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)大黃素可明顯抑制低氧環(huán)境下SGC7901細(xì)胞的增殖，而且抑制率隨濃度和時間的增加而增大，證實了大黃素的抗腫瘤活性。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，HIF-1α在SGC7901細(xì)胞中的表達(dá)隨大黃素濃度增加而降低(r=-0.646，P=0.023<0.05)，而E-cadherin蛋白的表達(dá)則與大黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)(r=0.816，P=0.001<0.05)。大黃素干預(yù)后，HIF-1α和E-cadherin蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)出了相反的趨勢，這一結(jié)論和多數(shù)學(xué)者研究結(jié)果相同，即E-cadherin是HIF-1α下游的靶基因，HIF-1α可活化上調(diào)E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子[4-5]。因此，筆者認(rèn)為大黃素可能通過降低HIF-1α，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)這條通路，來殺傷腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。

在實驗過程中，筆者發(fā)現(xiàn)大黃素還可影響SGC7901細(xì)胞的形態(tài)。正常生長的SGC7901細(xì)胞為多邊形，核大、位于細(xì)胞中央，細(xì)胞間橋密集可見。隨著大黃素濃度的增加，細(xì)胞呈現(xiàn)多態(tài)性，其表面的突起逐漸變得粗大、延長，最后體積逐漸縮小，變?yōu)樾A形，細(xì)胞間橋也隨細(xì)胞與細(xì)胞之間的距離增大而消失。筆者推斷細(xì)胞出現(xiàn)這種變化的原因可能為：大黃素影響了腫瘤細(xì)胞之間的連接作用，而發(fā)揮這一作用的蛋白質(zhì)是E-cadherin，免疫組織化學(xué)結(jié)果也恰好證實了這一點[6-11]。

根據(jù)本實驗結(jié)果推斷：在低氧環(huán)境下，大黃素可能通過降低HIF-1α和增強其下游靶基因E-cadherin的表達(dá)這一通路來減弱腫瘤細(xì)胞對缺氧的耐受，使其增殖、遷移活性下降，甚至死亡，從而實現(xiàn)治療腫瘤的效果。