周華金 楊家昶 張 輝 王繼光 郝洋洋 杜 鵬 宋志剛

(山東農業(yè)大學動物科技學院/動物醫(yī)學院，泰安271018)

應激導致家禽能量代謝異常，闡明糖皮質激素影響肝臟脂肪、膽汁酸合成的途徑對揭示應激機理、制定防控策略意義重大。糖皮質激素參與機體脂肪代謝，肥胖糖尿病小鼠模型和一些胰島素抵抗患者體內糖皮質激素水平升高，并與脂肪肝和高血糖的發(fā)生相關[1-2]。合成的和天然的糖皮質激素都能夠高度調節(jié)肝臟脂肪代謝，在小鼠原代肝細胞上的研究表明，地塞米松(dexamethasone，DEX)促進蛋白質依賴性脂肪酸的攝取，增加三酰甘油和鞘脂的積累[3]。此外，糖皮質激素參與膽汁酸代謝，小鼠肝臟特異性敲除糖皮質激素受體基因后，膽囊中膽汁酸的含量降低[4]；糖皮質激素通過誘導膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7-alpha hydroxylase, CYP7A1)的活性來調節(jié)大鼠肝細胞中膽汁酸的合成[5]。肉雞飲水中添加地塞米松抑制了三羧酸循環(huán)和脂肪酸氧化，促進了肉雞肝臟脂肪酸從頭合成[6]。目前，有關應激調控家禽肝臟代謝的研究多基于活體試驗，所得結果是糖皮質激素、胰島素等多個因素的共同影響，尚需通過體外試驗探究糖皮質激素的直接效應。因此，本試驗使用不同濃度的地塞米松處理雞胚肝細胞，通過實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術對脂肪、膽汁酸合成相關基因進行定量，以揭示糖皮質激素的單一影響，為深入研究應激影響家禽能量代謝的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

地塞米松注射液(5 mg/mL)購自山東魯抗晨欣藥業(yè)有限公司，RNA提取試劑盒購自康為試劑生物有限公司(CW0584)，反轉錄試劑盒(編號：4897030001)購自羅氏公司，Real Time PCR試劑盒(編號：4913914001)購自羅氏公司。固醇調節(jié)元件結合蛋白-1C(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1C)、肝臟X受體(liver X

receptor,LXR)、載脂蛋白B(apolipoprotein B,APOB)100、脂肪酸轉運蛋白1(fatty acid transport protein 1,FATP-1)、CYP7A1、法尼酯X受體(farnesoid X receptor,FXR)、膽鹽輸出泵(bile salt export pump,BSEP)和膽汁酸攝取相關基因Na+/?；悄扄}共轉運體(Na+/taurocholate co-transporting polypeptide,NTCP)基因的引物序列見表1，由上海生工生物技術有限公司合成。采用2-ΔΔCT法[7]定量目標基因的mRNA相對表達水平，以β-肌動蛋白(β-actin)作為參照基因進行校準。

表1 引物序列

F：上游 forward；R：下游 reverse。

1.2 試驗設計

選取19胚齡的無特定病原體(SPF)雞蛋，原代培養(yǎng)雞胚肝細胞，細胞以1×106個/mL密度接種于6孔板中，每個孔作為1個重復，常規(guī)(37 ℃、5% CO2)培養(yǎng)，每24 h更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)72 h后根據試驗處理不同分別加入0(對照)、200、500和1 000 nmol/L的地塞米松，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分別收集細胞上清液、肝細胞，利用RT-PCR技術進行基因定量。

1.3 基因定量

反轉錄條件為：55 ℃，30 min(反轉錄反應)；85 ℃，5 min(反轉錄酶的失活反應)。兩步法熒光定量PCR反應條件為：第1步95 ℃變性10 s，1個循環(huán)，第2步95 ℃延伸5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計分析

使用SAS 9.0軟件中GLM程序對試驗數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，平均值采用Tukey’s HSD法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 地塞米松對雞胚肝細胞脂肪代謝相關基因mRNA相對表達水平的影響

由圖1-A、圖1-C、圖1-D可知，與對照組相比，500和1 000 nmol/L地塞米松處理分別顯著降低了雞胚肝細胞FATP-1、APOB100和LXR的mRNA相對表達水平(P<0.05)；由圖1-B可知，200、500、1 000 nmol/L地塞米松處理均顯著降低了雞胚肝細胞SREBP-1C的mRNA相對表達水平(P<0.05)。

數據柱標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖1地塞米松對雞胚肝細胞脂肪代謝相關基因mRNA相對表達水平的影響

Fig.1 Effects of DEX on mRNA relative expression levels of fat metabolism related genes in chicken embryo hepatocyte

2.2 地塞米松對雞胚肝細胞膽汁酸代謝相關基因mRNA相對表達水平的影響

由圖2-A、圖2-B可知，與對照組相比，200 nmol/L地塞米松處理顯著提高了雞胚肝細胞CYP7A1和FXR的mRNA相對表達水平(P<0.05)；由圖2-C可知，500和1 000 nmol/L地塞米松處理顯著降低了雞胚肝細胞NTCP的mRNA相對表達水平(P<0.05)；由圖2-D可知，200、500和1 000 nmol/L地塞米松處理均顯著提高了雞胚肝細胞BSEP的mRNA相對表達水平(P<0.05)。

3 討 論

3.1 糖皮質激素與雞胚肝細胞脂肪代謝

在禽類，脂肪酸的合成反應與哺乳動物相同，脂肪酸和甘油三酯的合成主要在肝臟，并受多種蛋白質的調節(jié)。有研究表明，糖皮質激素與脂肪代謝密切相關，大鼠按0.05 mg/kg劑量每天灌服地塞米松7周后，肝臟脂肪含量下降，脂肪合成相關基因：脂肪酸結合蛋白-1(FABP-1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸酰胺轉移酶(GPAT)基因在肝臟中的mRNA相對表達水平下降[8]，提示地塞米松具有抑制脂肪合成的作用。在肝臟，脂肪酸可以通過脂肪酸轉運蛋白(fatty acid transport protein，F(xiàn)ATP)家族介導的主動吸收穿越質膜，其中FATP-1可以促進長鏈脂肪酸進出細胞的通量，此外，F(xiàn)ATP-1可通過調節(jié)細胞內脂肪酸?；饔枚绊懠毎麅戎舅岽x和脂質蓄積[9-10]。在本研究中，高劑量地塞米松處理顯著降低了雞胚肝細胞FATP-1的mRNA相對表達水平，表明糖皮質激素對肝細胞脂肪酸合成具有抑制作用。

圖2 地塞米松對雞胚肝細胞膽汁酸代謝相關mRNA相對表達水平的影響

LXR和SREBP-1C同樣在脂肪合成過程中發(fā)揮關鍵作用。LXR是膽固醇水平的感受器，并能調節(jié)與膽固醇吸收、轉運、流出、排泄有關的一系列基因，其過度表達會使脂肪合成相關酶的基因轉錄明顯加強。在朗德鵝上的研究發(fā)現(xiàn)，LXRα的mRNA相對表達水平增加可促進鵝肝臟脂肪沉積[11]。在甘油三酯的合成中，脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰輔酶A(ACC)是限速酶。FAS和ACC的表達受SREBP-1C的調控[12]。當細胞內膽固醇含量過高，LXRs激活SREBP-1C，后者可增加油酸的合成，增多的不飽和脂肪酸與過多的膽固醇酯化，從而促進膽固醇的儲存；而減少LXRs的激活可抑制SREBP-1C的轉錄，從而減少脂肪形成和甘油三酯合成。在本研究中，高劑量地塞米松處理顯著降低了LXR和SREBP-1C的mRNA相對表達水平，同樣表明糖皮質激素對脂肪合成具有抑制作用。

APOB是極低密度脂蛋白(VLDL)的組成成分，是脂蛋白合成、分泌、運輸的骨架蛋白，對能量轉運、代謝等有顯著作用。VLDL將甘油三酯從肝臟運送到外周組織，肝細胞內過量合成APOB導致血漿中VLDL和低密度脂蛋白(LDL)含量升高，可引發(fā)動脈粥樣硬化等心腦血管疾病，還可導致肝臟細胞內脂質積累，引發(fā)脂肪肝[13]。此外，雞APOB基因SNP(T123G)對腹脂和腹脂率有顯著影響[14-15]。在本研究中，高劑量地塞米松處理顯著下調了肝細胞APOB100的mRNA相對表達水平，提示糖皮質激素具有抑制脂蛋白組裝轉運的作用。

3.2 糖皮質激素與雞胚肝細胞膽汁酸代謝

膽汁酸在肝臟實質細胞中由膽固醇合成，CYP7A1是膽汁酸合成的限速酶[16]。研究表明，糖皮質激素對膽汁酸合成具有劑量依賴性刺激作用，50 nmol/L地塞米松處理大鼠肝細胞發(fā)現(xiàn)，第2天和第3天膽汁酸的合成水平分別上升了3倍和7倍；1 μmol/L地塞米松處理2 d后，肝細胞膽汁酸合成水平上升了2.2倍[17]。糖皮質激素通過誘導CYP7A1活性調節(jié)大鼠肝細胞膽汁酸合成[5]。地塞米松和甲狀腺素聯(lián)合作用能顯著提升人和大鼠肝細胞中總膽汁酸的合成，使膽酸的含量提高了23%，二羥膽酸的含量提高了77%，CYP7A1的活性也提高，在培養(yǎng)的肝細胞上，27-羥化酶mRNA并不自然出現(xiàn)，培養(yǎng)液中添加地塞米松72 h后，27-羥化酶mRNA出現(xiàn)，說明地塞米松可提高CYP7A1和固醇27羥化酶的活性,從而調節(jié)膽汁酸合成[18]。與前人研究相似，本研究中低水平地塞米松處理促進了CYP7A1的mRNA相對表達水平，證實了糖皮質激素可促進膽汁酸的合成。

NTCP位于肝細胞基底膜，是攝取膽汁酸的主要轉運體。有報道證明，地塞米松是大鼠肝臟中BSEP的強效誘導劑，大鼠肝細胞在100 nmol/L地塞米松的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后，BSEP具有較強的功能活性[17]，這與本研究中地塞米松誘導BSEP的mRNA相對表達水平上升的結果相一致。

有研究表明，CYP7A1受到FXR的負反饋調控，在肝臟中，F(xiàn)XR通過激活下游靶基因SHP抑制CYP7A1的表達，減少了膽汁酸的合成[19-20]。此外，肝臟中的FXR被膽汁激活后，下調了NTCP的基因表達，提高了膽汁酸外流轉運體BSEP的基因表達[21-22]。在本研究中，200 nmol/L地塞米松處理促進了雞肝細胞CYP7A1和FXR的mRNA相對表達水平，500和1 000 nmol/L地塞米松處理抑制了NTCP的mRNA相對表達水平，提高了BSEP的mRNA相對表達水平，提示低水平糖皮質激素可以促進雞胚肝細胞膽汁酸的合成和排出，高水平糖皮質激素抑制膽汁酸攝取。

4 結 論

高劑量糖皮質激素對雞胚肝細胞的脂肪合成、轉運和膽汁酸的攝取具有抑制作用；低劑量糖皮質激素可以促進膽汁酸的合成和排出，部分反應具有劑量依賴性。

致謝：

感謝山東農業(yè)大學動物科技學院趙景鵬老師對論文撰寫的指導。