任 曼 黃金歌 靳二輝 車傳燕 胡倩倩 周金星 李升和

(安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，鳳陽(yáng)233100)

幼齡動(dòng)物腸道功能發(fā)育尚未完善，腸道健康對(duì)幼齡動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，直接影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)效益，鑒于抗生素濫用問題的多發(fā)，通過營(yíng)養(yǎng)調(diào)控手段提高幼畜腸道功能具有切實(shí)的意義。蘇氨酸不僅用于機(jī)體蛋白質(zhì)合成，還參與機(jī)體其他生理功能如免疫等[1-2]，哺乳動(dòng)物從食物中攝取的蘇氨酸有60%～80%被用于門靜脈排流組織(partal-drained viscera,PDV)代謝[1]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸對(duì)幼齡動(dòng)物腸道黏膜免疫功能和消化功能具有一定的作用，蘇氨酸缺乏會(huì)降低腸道消化酶活性，增加黏膜通透性并，降低腸道黏膜蛋白合成，進(jìn)而直接影響機(jī)體健康[3-5]；適宜濃度的蘇氨酸可增強(qiáng)腸道黏膜屏障功能，促進(jìn)腸道內(nèi)免疫球蛋白A(IgA)分泌并提高消化酶活性[6-7]。有關(guān)蘇氨酸的研究多集中在動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，蘇氨酸對(duì)腸道功能調(diào)節(jié)作用的機(jī)制研究缺乏，尤其是在細(xì)胞水平的研究。腸道上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中的蘇氨酸濃度一般為0.449 mmol/L (0.053 45 g/L)，本試驗(yàn)以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了蘇氨酸的添加濃度。前人研究表明，來(lái)源于大鼠空腸隱窩上皮的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞株IEC-6細(xì)胞與正常的小腸隱窩細(xì)胞具有相同的形態(tài)學(xué)特征、生長(zhǎng)特性、合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力以及細(xì)胞專一性的質(zhì)膜抗原[8]。IEC-6細(xì)胞存活力強(qiáng)、增殖速度快、易保存和培養(yǎng)，很適合用于腸道功能相關(guān)的試驗(yàn)研究。本研究以大鼠小腸上皮細(xì)胞系IEC-6細(xì)胞為對(duì)象，通過分析不同濃度蘇氨酸對(duì)IEC-6細(xì)胞活性、增殖和緊密連接蛋白表達(dá)的影響，研究蘇氨酸在不同濃度下對(duì)小腸上皮細(xì)胞的作用，初步探究蘇氨酸對(duì)腸道屏障功能的可能作用機(jī)制，為蘇氨酸在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大鼠小腸上皮細(xì)胞系IEC-6細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)、蘇氨酸(99.9%，Sigma，美國(guó))、高糖DMEM培養(yǎng)基(HyClone，美國(guó))、胎牛血清(FBS)(Gibco，美國(guó))、胰島素(注射用)、胰蛋白酶(Gibco，美國(guó))、噻唑蘭(MTT)(Amresco，美國(guó))、二甲基亞砜(DMSO)、伊紅(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、蘇木精(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、FSHR兔多克隆抗體(Abcam，英國(guó))、山羊抗兔免疫球蛋白(H+L)抗體(拜力生物科技有限公司)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、Western-blot試劑(10×)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、化學(xué)發(fā)光顯影定影試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)定

1.2.1 IEC-6細(xì)胞培養(yǎng)

凍存的IEC-6細(xì)胞迅速在37 ℃水浴鍋中溶解，轉(zhuǎn)入離心管，加入含10%FBS、0.01 mg/mL胰島素的高糖DMEM培養(yǎng)基，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，用高糖DMEM培養(yǎng)基混勻細(xì)胞，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，置于5%CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)IEC-6細(xì)胞活性

96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，每孔含104個(gè)細(xì)胞[邊緣孔用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)填充]，5%CO237 ℃孵育24 h。小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL蘇氨酸處理液，蘇氨酸處理液中蘇氨酸濃度分別設(shè)定為0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置4～6個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔和對(duì)照孔，5%CO237 ℃孵育24 h。每孔再加入20 μL終濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀低速振蕩10 min，在490 nm處測(cè)量各孔的吸光度(OD)值。

1.2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察IEC-6細(xì)胞增殖情況

將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，底部鋪上細(xì)胞爬片，待細(xì)胞生長(zhǎng)愈合至80%時(shí)，加入不同濃度(0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mmol/L)的蘇氨酸處理液，處理24 h后進(jìn)行HE染色。用PBS洗滌2～3次，晾干，甲醇固定5～8 min，PBS再洗2～3次，蒸餾水沖洗1遍，玻片甩干，蘇木精染色5 min，自來(lái)水沖洗干凈，1% NaHCO3洗至藍(lán)色，玻片晾干，伊紅染色5 min，無(wú)水乙醇沖洗干凈后，無(wú)水乙醇洗2次，每次1～2 min，醇苯洗2次，每次1～2 min，最后用二甲苯洗5～10 min，玻片自然晾干，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況。

1.2.4 Western-blot法檢測(cè)IEC-6細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)情況

蛋白樣品的準(zhǔn)備：細(xì)胞接種于6孔板，每孔3 mL培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%，吸去培養(yǎng)基，PBS洗3遍，每孔加入2 mL無(wú)氨基酸培養(yǎng)基，處理2 h。吸去培養(yǎng)基，加入2 mL不同濃度(0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mmol/L)的蘇氨酸處理液處理24 h。棄去處理液，每孔加入60 μL蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物，10 min后收集細(xì)胞，蛋白質(zhì)抽提試劑盒提取細(xì)胞蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試盒測(cè)定蛋白濃度。按照5×上樣緩沖液制備蛋白樣品。配制SDS-PAGE凝膠，每孔上樣30 μg蛋白樣品，在90 V恒壓下電泳至分離膠，然后再在120 V恒壓下電泳至溴酚藍(lán)剛跑出分離膠底部。電泳完畢后，聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜，封閉和抗體孵育，將PVDF膜放入AlphaImager 2200(Alpha Innotech，美國(guó))系統(tǒng)中進(jìn)行曝光、攝像。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS 9.4軟件中的單因素方差分析程序進(jìn)行分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度蘇氨酸對(duì)IEC-6細(xì)胞活性的影響

如圖1所示，經(jīng)不同濃度的蘇氨酸處理后，IEC-6細(xì)胞活性均有不同程度的提高，蘇氨酸濃度為0.5 mmol/L時(shí)IEC-6細(xì)胞的活性最高，且與未經(jīng)蘇氨酸處理的對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，但超過這個(gè)濃度后IEC-6細(xì)胞的活性開始下降，在數(shù)值上仍高于未經(jīng)蘇氨酸處理的IEC-6細(xì)胞，但差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明適宜濃度的蘇氨酸可提高大鼠小腸上皮細(xì)胞的活性。

數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Data points with different small letters mean significant difference (P<0.05), while with the same letters mean no significant difference (P>0.05).

圖1不同濃度蘇氨酸對(duì)IEC-6細(xì)胞活性的影響

Fig.1 Effects of threonine with different concentrations on IEC-6 cell activity

2.2 不同濃度蘇氨酸對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖的影響

不同濃度蘇氨酸處理IEC-6細(xì)胞24 h之后細(xì)

胞形態(tài)和增殖情況如圖2所示。在空間和營(yíng)養(yǎng)充足情況下，IEC-6細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)上呈長(zhǎng)橢圓形、梭形，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形且位于細(xì)胞中央。與未經(jīng)蘇氨酸處理的對(duì)照組相比，不同濃度的蘇氨酸均能促進(jìn)IEC-6細(xì)胞的增殖，且在蘇氨酸濃度為0.5～1.0 mmol/L時(shí)促增殖作用最明顯，再增加蘇氨酸濃度，則細(xì)胞濃度降低，但仍大于對(duì)照組，此結(jié)果與MTT法檢測(cè)的細(xì)胞活性結(jié)果一致。

2.3 不同濃度蘇氨酸對(duì)IEC-6細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響

以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，圖3所示為不同濃度蘇氨酸對(duì)IEC-6細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響。分析結(jié)果表明，與未經(jīng)蘇氨酸處理的對(duì)照組相比，0.1 mmol/L的蘇氨酸對(duì)緊密連接蛋白claudin-3的表達(dá)沒有產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，但顯著促進(jìn)了occludin的表達(dá)(P<0.05)；蘇氨酸濃度為0.5、1.0、5.0、10.0 mmol/L時(shí)均顯著促進(jìn)上述2種緊密連接蛋白的表達(dá)(P<0.05)，其中claudin-3的相對(duì)表達(dá)量分別增加了1.84、7.08、8.71、3.83倍，occludin的相對(duì)表達(dá)量分別增加了2.65、2.71、2.82、3.88倍，以蘇氨酸濃度為5.0 mmol/L時(shí)claudin-3的相對(duì)表達(dá)量最高，以蘇氨酸濃度為10.0 mmol/L時(shí)occludin的相對(duì)表達(dá)量最高。

圖2 不同濃度蘇氨酸對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖的影響(HE染色，200×)

3 討 論

目前，蘇氨酸已在畜牧養(yǎng)殖、食品和醫(yī)藥等行業(yè)中廣泛應(yīng)用，其在維持畜禽正常的生長(zhǎng)發(fā)育和免疫功能中發(fā)揮著重要的作用。適量蘇氨酸可以平衡飼糧中氨基酸組成，降低飼糧蛋白質(zhì)水平，并通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)[9]和腸道黏膜蛋白合成[10]等機(jī)制提高幼齡動(dòng)物腸道屏障功能，增強(qiáng)對(duì)病原微生物的抵御作用，提高免疫力和抗病能力[11]。哺乳動(dòng)物腸道不僅是機(jī)體消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的首要部位，還是阻擋有害病原和病原菌入侵的首要屏障，對(duì)動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育起到重要作用[12]。腸道黏膜黏液含量、形態(tài)學(xué)狀況、上皮細(xì)胞通透性、刷狀緣酶活性等決定著腸道黏膜的完整性，其中腸道黏膜上皮細(xì)胞及其之間的連接共同構(gòu)成了腸道的機(jī)械屏障，直接決定著腸道功能是否正常[3]。小腸隱窩上皮細(xì)胞在腸道細(xì)胞中是一種重要的功能性細(xì)胞，腸道黏膜損傷后主要依靠隱窩上皮細(xì)胞的不斷增殖、分化來(lái)完成修復(fù)，以重建腸道的屏障功能[13]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中標(biāo)準(zhǔn)回腸可消化蘇氨酸水平為7.5～11.1 g/kg時(shí)可顯著提高斷奶仔豬腸道屏障功能并降低大腸桿菌感染率[11]；在豬空腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)中，53.45、106.90、160.35 mg/L的蘇氨酸均可不同程度地提高細(xì)胞先天性免疫功能，并可上調(diào)白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-5(IL-5)的表達(dá)[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的蘇氨酸可提高大鼠小腸上皮細(xì)胞系IEC-6細(xì)胞的活性，增加其緊密連接蛋白的表達(dá)，從而提高小腸的機(jī)械屏障功能，促進(jìn)腸道健康，與前人研究結(jié)果一致。其中，0.5 mmol/L蘇氨酸對(duì)IEC-6細(xì)胞活性和增殖的促進(jìn)作用最顯著，5.0和10.0 mmol/L蘇氨酸對(duì)occludin和claudin-3表達(dá)的促進(jìn)作用最顯著。細(xì)胞的增殖和活性需要多種營(yíng)養(yǎng)素和生長(zhǎng)因子的功能調(diào)控，而緊密連接蛋白的合成除了受基因調(diào)控外還有氨基酸底物的影響，底物濃度越高蛋白質(zhì)合成速度越快，所以出現(xiàn)了本試驗(yàn)中的最適濃度差異。但當(dāng)單一氨基酸濃度過高時(shí)會(huì)影響其他氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而降低蛋白質(zhì)的合成，本試驗(yàn)結(jié)果表明，蘇氨酸濃度達(dá)到10.0 mmo/L時(shí)并未造成其他氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)拮抗。由于本試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的蘇氨酸濃度范圍較大，需要縮窄濃度范圍深入探究蘇氨酸對(duì)小腸上皮細(xì)胞活性、增殖和緊密連接蛋白表達(dá)的最適濃度范圍。緊密連接是上皮細(xì)胞之間的重要連接體，與腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和微生物的黏附關(guān)系密切，參與多種信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等[14]。occludin是第1個(gè)被確認(rèn)的緊密連接特異性跨膜蛋白，是上皮細(xì)胞緊密連接中主要表達(dá)的蛋白，其在細(xì)胞旁滲透性的調(diào)控中起著非常重要的作用[15]。claudin家族被認(rèn)為是緊密連接蛋白的“脊梁”，其可調(diào)控腸道上皮的屏障功能[16]，occludin與claudin直接或間接地相互作用。本研究中，不同濃度的蘇氨酸可不同程度地促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞中occludin與claudin-3的表達(dá)，說(shuō)明蘇氨酸對(duì)腸道的通透性和屏障功能均具有調(diào)節(jié)作用，也證實(shí)了前人動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果[6-7]。國(guó)內(nèi)外研究中有關(guān)蘇氨酸對(duì)細(xì)胞活性和增殖影響的研究較為缺乏，已有研究發(fā)現(xiàn)，多種功能性氨基酸如亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸等可提高小腸上皮細(xì)胞的增殖并增加腸道屏障功能[17-19]。亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸和蘇氨酸均可為腸道供能并參與多種腸道蛋白質(zhì)的合成，其中大部分蘇氨酸(71%)作為合成黏膜上皮細(xì)胞蛋白和分泌蛋白的底物，少部分(2%～9%)蘇氨酸氧化為腸道上皮細(xì)胞供能[1]。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，蘇氨酸可能是通過保證腸道上皮細(xì)胞的能量供給和為細(xì)胞活性和增殖所需的蛋白提供了底物，進(jìn)而提高了細(xì)胞活性，促進(jìn)了細(xì)胞增殖和緊密連接蛋白的表達(dá)。

“*”表示與未經(jīng)蘇氨酸處理的對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

“*”mean significant difference compared with control group which treated without threonine.

圖3不同濃度蘇氨酸對(duì)IEC-6細(xì)胞緊密

連接蛋白o(hù)ccludin和claudin-3表達(dá)的影響

Fig.3 Effects of threonine with different concentrations on expression of tight junction proteins occludin and claudin-3 of IEC-6 cell

4 結(jié) 論

綜上，適宜濃度的蘇氨酸對(duì)大鼠小腸上皮細(xì)胞系IEC-6細(xì)胞的活性和增殖具有促進(jìn)作用，且在濃度為0.5 mmol/L時(shí)作用最顯著，同時(shí)促進(jìn)了緊密連接蛋白claudin-3和occludin的表達(dá)。