馬文瑞，嚴(yán)密，劉業(yè)偉，江偉，全莉，王雪薇，武運*，薛潔*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 3(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京，100083)

葡萄屬于葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(VitisL.)，分布于世界溫帶、亞熱帶，不僅可以鮮食，還能釀酒、制汁和制干，是重要的經(jīng)濟作物[1-2]?，F(xiàn)在有一定栽培面積的優(yōu)良品種主要為赤霞珠、美樂、霞多麗等[3-5]。隨著我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展，每年還有新品種不斷引進，因此進行釀酒葡萄種質(zhì)資源鑒定保護和葡萄酒鑒偽是我國葡萄酒行業(yè)規(guī)范發(fā)展和質(zhì)量監(jiān)控的重要措施。

葡萄繁殖方式主要為無性繁殖，不同葡萄酒產(chǎn)區(qū)間互相引種，并對外來優(yōu)良新品種的引進，出現(xiàn)同名異物，同物異名等品種混淆問題，又因葡萄種間雜交過程中產(chǎn)生中間型和過渡型雜種的概率較高[6]。面對葡萄品種間極其豐富的多樣性變異，傳統(tǒng)的鑒定方法已經(jīng)受到諸多限制，然而DNA指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展解決了這一問題。該技術(shù)能夠從分子水平檢測基因組中的遺傳信息和序列多態(tài)性，兼?zhèn)涮禺愋院头€(wěn)定性都較高的特點，能夠快速對親緣關(guān)系較近的種質(zhì)個體進行鑒定[7]。

簡單序列重復(fù) (simple sequence repeats, SSR)技術(shù)也稱微衛(wèi)星技術(shù)，是目前廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定、保護、遺傳多樣性分析和遺傳圖譜建立等方面的DNA指紋圖譜分析技術(shù)。該技術(shù)具有共顯性、靈敏度高、多態(tài)性高和重復(fù)性好等優(yōu)點，可為植物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，建立品種SSR指紋圖譜提供便利[8-9]。溫景輝等人利用SSR標(biāo)記技術(shù)對20份葡萄原料進行了種質(zhì)親緣關(guān)系分析，所有種質(zhì)總共分為4大類群，其中，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的類群是山葡萄與歐亞種、美洲雜種，親緣關(guān)系較近的類群是歐亞種與美洲種[10]。劉偉等人利用15對SSR引物對 21 種不同類型葡萄種質(zhì)進行PCR擴增，對其遺傳多樣性進行了分析，SSR標(biāo)記技術(shù)能夠從分子水平上解析不同類型葡萄種質(zhì)的遺傳差異性，并能揭示材料間親緣關(guān)系[11]。王慧玲等人利用9對SSR引物對13個新葡萄品種進行SSR分析，最終得到所有品種分子身份證，能夠?qū)⑺泄┰嚥牧嫌行^(qū)分[12]。樊秀彩等人篩選出能擴增出父本特異性條帶的7對SSR引物對239株山葡萄和河岸葡萄的雜交后代進行鑒定，161株后代具有父本的特異性條帶，另外，后代中還出現(xiàn)了新的條帶，表明雜交后代產(chǎn)生了豐富的變異[13]。

本研究選取新疆天山北麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)10個優(yōu)良紅白釀酒葡萄品種為試材，利用SSR標(biāo)記分析技術(shù)，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠擴增片段圖譜，分析紅白釀酒葡萄品種之間的親緣關(guān)系，建立10個釀酒葡萄品種的分子身份證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取新疆天山北麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的10個優(yōu)良釀酒葡萄品種果實(表1)，置于-80 ℃冰箱貯藏備用。

表1 十個釀酒葡萄品種及其分子身份證編碼Table 1 Ten Vitis vinifera varieties and its molecular ID

10×PCR buffer[100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2]，dNTPs，TaqDNA聚合酶和6×Loading Buffer等購買于TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；D2000 DNA marker購買于天根生化科技(北京)有限公司；所有PCR引

物，毛細(xì)管電泳所用引物5′-FAM(藍(lán)色)標(biāo)記均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；HIDI，LIZ500購買于美國 ABI 公司；其他試劑均為分析純購自北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

測序列分析儀(3730XL)，美國 ABI 公司；VeritiTM96-Well Thermal Cycler 梯度PCR儀，美國ABI公司；垂直電泳槽(JY-CZ-BL)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；電泳儀(BG-Power600)，北京百晶生物技術(shù)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 1600)，天能科技(上海)有限公司；BioSpec-nano核酸蛋白檢測儀，德國Eppendorf公司；微量移液器，德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒葡萄品種總DNA提取及質(zhì)量檢測

根據(jù)葡萄特性，將傳統(tǒng)的十六烷基三甲基溴化銨法(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)進行改良，有效提高了葡萄總DNA的質(zhì)量。具體步驟參考齊玲倩等人的《水果果肉中總DNA提取方法的比較研究》[14]。使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的片段大小和質(zhì)量，并使用核酸蛋白儀檢測樣品總DNA的濃度和純度，將樣品濃度稀釋至40 ng/μL。

1.3.2 PCR擴增和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

本研究根據(jù)葡萄公共遺傳圖譜NCBI，確定選用12對國際通用的SSR引物用于PCR擴增，引物序列見表2。

表2 十二對SSR引物及其退火溫度Table 2 Twelve sequence and annealing temperature of SSR primer

注：F-上游引物；R-下游引物；Tm-退火溫度。

釀酒葡萄普通SSR-PCR擴增反應(yīng)，采用25 μL反應(yīng)體系，其中包含有Mg2+濃度2.5 mmol/L，dNTPs為0.15 mmol/L，Taq酶為1.5 U，引物為0.5 μmol/L，DNA含量為40 ng/25 μL，剩余用雙蒸水補足[18]。

SSR-PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，退火溫度60 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。

SSR-PCR擴增產(chǎn)物，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，200 V，120 min。銀染顯色主要操作如下：染色 15 min，蒸餾水沖洗1～2次，顯色5 min，再次用蒸餾水沖洗1～2次，直至條帶清晰為止。

1.3.3 PCR擴增和毛細(xì)管電泳檢測

綜合1.3.2非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜結(jié)果和經(jīng)濟成本角度考慮，最終選取多態(tài)性良好，重復(fù)性較好的5對SSR引物進行正向引物的5′-FAM標(biāo)記，它們分別是VrZAG62，VrZAG79， VVMD5，VVMD27和VVS2。

釀酒葡萄SSR-PCR擴增反應(yīng)，采用25 μL反應(yīng)體系，其中包含有Mg2+濃度2.0 mmol/L，dNTPs為0.2 mmol/L，Taq酶為1.0 U，引物為0.5 μmol/L，DNA含量為40 ng/25 μL，剩余用雙蒸水補足。SSR-PCR反應(yīng)程序第一階段：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s， 60 ℃退火30 s ，72 ℃延伸30 s，共10個循環(huán)。第二階段：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共20個循環(huán)，最后72 ℃修復(fù)延伸6 min。

SSR-PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)物，采用毛細(xì)管電泳法進行檢測。具體步驟如下：吸取990 μL HIDI和10 μL LIZ500進行混勻，然后吸取10 μL混合物加入到96孔反應(yīng)板中；迅速將96孔板置于平板離心機中，離心到500×g結(jié)束；對照上機檢測表，在96孔板對應(yīng)的孔中加入相對應(yīng)的50 pg樣品；再次將96孔板置于平板離心機中，離心到500×g結(jié)束；使用封板膜密封96孔板，振蕩，再次離心到500×g結(jié)束；置于PCR儀中；變性程序為98 ℃，5 min，不加熱蓋，程序結(jié)束后立即冷卻96孔板；然后將96孔板置于平板離心機中，離心到2 000×g結(jié)束；最后將PCR產(chǎn)物使用ABI 3730XL全自動基因分析儀進行檢測分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

SSR-PCR產(chǎn)物通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染后拍照，根據(jù)電泳圖譜多態(tài)性條帶并賦值分析。相同電泳遷移率下的清晰條帶賦值為“1”，無擴增條帶的記為“0”，擴增條帶不清晰將不進行統(tǒng)計，最終得到0/1數(shù)據(jù)矩陣結(jié)果，再利用NTSYSpc2.10e軟件進行后續(xù)分析，不同釀酒葡萄品種之間的遺傳相似系數(shù)利用NTSYSpc2.10e軟件得出結(jié)果。首先利用軟件中Similarity中的Qualitative Date功能計算不同品種間的遺傳相似系數(shù)，然后采用非加權(quán)類平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean, UPGMA)進行聚類分析，最終利用Graphics功能得出聚類分析樹狀圖。根據(jù)SSR-PCR非變性聚丙烯酰胺凝膠圖譜，將所有品種不用引物的譜帶進行有序編碼轉(zhuǎn)換，建立10個釀酒葡萄品種的分子身份證。根據(jù)每對引物對不同品種有效譜帶分子量大小，從小到大有序編碼為1～9，如果條帶數(shù)超過9條，依次增加A～Z進行編碼。如果SSR引物在其中一個樣品中擴增出多個等位片段，選擇分子量較小的分子量對其編碼[19]。

根據(jù)ABI 3730XL出現(xiàn)的峰圖與內(nèi)標(biāo)LIZ500 進行比較，根據(jù)峰面積和出峰時間得出每個樣品在SSR位點的片段大小，使用Genemapper軟件分析樣品SSR數(shù)據(jù)，具體分析步驟參照尹玲等人的《我國新育成葡萄品種SSR指紋圖譜的建立》[20]。最終得出釀酒葡萄品種在SSR位點的熒光指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性分析

根據(jù)葡萄果實特性改良的 CTAB法提取總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白儀測定樣品DNA的質(zhì)量，結(jié)果顯示樣品的DNA 的濃度和純度已達到SSR分子標(biāo)記要求，并將所有樣品的DNA濃度稀釋至40 ng/μL。SSR-PCR的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜顯示，所有品種擴增條帶清晰。本試驗利用12對SSR引物在供試材料中檢測到56個等位基因，SSR引物擴增的條帶范圍為13～28條，平均17.75條。片段長度介于100～800 bp，200～500 bp擴增片段較多。引物VVMD27擴增出 13 條條帶，是擴增條帶數(shù)最少的引物；VVMD8是擴增條帶數(shù)最多的引物，多達 28 條。引物 VrZAG64擴增片段分子量范圍最大，為150～800 bp；引物 VVS2擴增片段分子量范圍最小，為140～340 bp。12對SSR引物共擴增213條擴增片段，均為多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率為 100%，具體見表3。

2.2 釀酒葡萄品種的遺傳相似系數(shù)分析

本研究根據(jù)圖譜結(jié)果，得出 0/1矩陣統(tǒng)計結(jié)果，對不同品種之間的遺傳距離進行了計算，結(jié)果見表4。10個釀酒品種中，不同樣品間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.67～0.85之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.76。其中“赤霞珠”和“美樂”之間遺傳相似系數(shù)最高，為0.85，“小芒森”與“貴人香”，遺傳相似系數(shù)相對最低，為0.67。

表3 不同SSR引物對10個釀酒葡萄品種的SSR-PCR 擴增產(chǎn)物多態(tài)性比較Table 3 Comparison of the polymorphism of SSR-PCR amplified products of 10 Vitis vinifera varieties withdifferent SSR primers

2.3 不同釀酒葡萄品種的SSR聚類分析

以所有樣品的擴增圖譜為基礎(chǔ)，根據(jù)0/1數(shù)據(jù)矩陣結(jié)果，使用NTSYSpc2.10e軟件進行UPGMA法聚類分析得出 10個釀酒葡萄品種的聚類樹狀圖，見圖1。結(jié)果顯示10個樣品在遺傳相似系數(shù) 0.73處產(chǎn)生了分離，將所有10份試驗樣品分成 2類。

第 1個大類包含有所有的紅葡萄品種，占所有樣品的70%，當(dāng)遺傳相似系數(shù)是0.76時，又分成了3個亞類，第1個亞類是“赤霞珠”和“美樂”，第2個亞類是“蛇龍珠”和“品麗珠”，均為歐亞種，這4個品種相對較近，原因是“品麗珠”是“赤霞珠”，“美樂”和“蛇龍珠”的親本之一。第3個亞類是“西拉”，“馬瑟蘭”和“小芒森”，其親緣關(guān)系與第1和第2個亞類相對較遠(yuǎn)。

第2個大類包含白葡萄品種和麝香葡萄，在遺傳相似系數(shù) 0.78時，又分成了2個亞類，第1個亞類有“霞多麗”和“貴人香”，第2個亞類是“玫瑰香”，單獨為一個分支。

表4 十個釀酒葡萄品種的遺傳相似系數(shù)Table 4 Genetic diversity of 10 Vitis vinifera varieties

圖1 基于SSR標(biāo)記的10個釀酒葡萄品種聚類分析樹狀圖Fig.1 UPGMA dendrogram of 10 Vitis vinifera varieties based on SSR results

2.4 釀酒葡萄品種分子身份證構(gòu)建

12對引物對10個釀酒葡萄品種擴增的等位基因譜帶大小分布范圍及賦值標(biāo)準(zhǔn)見表5。用篩選出的12對引物按照多樣性指數(shù)由低到高的順序進行區(qū)分，其中前6對引物就可以區(qū)分所有的試驗樣品，并構(gòu)建了10個釀酒葡萄品種分子身份證編碼，具體見表1。在所有引物擴增的結(jié)果中，每個品種最少有1個特異等位基因，如引物VrZAG79擴增結(jié)果顯示，“赤霞珠”，“美樂”，“西拉”，“馬瑟蘭”和“霞多麗”均有1個特異等位基因。如引物VVS2擴增結(jié)果顯示，“霞多麗”，“貴人香”，“玫瑰香”，“小芒森”，“蛇龍珠”，“西拉”和“馬瑟蘭”均有1個特異等位基因。

2.5 釀酒葡萄品種熒光標(biāo)記DNA指紋圖譜的建立

5對5′-FAM標(biāo)記的SSR引物VrZAG62，VrZAG79， VVMD5，VVMD27和VVS2，對所有供試品種進行毛細(xì)管電泳?；诿總€引物 PCR 產(chǎn)物片段大小，根據(jù)毛細(xì)管電泳峰圖的峰型以及每個峰值的大小建立，10個不同釀酒葡萄品種基于5對SSR 引物的分子標(biāo)記圖譜，圖2為部分釀酒葡萄品種在熒光標(biāo)記VrZAG79位點上的毛細(xì)管電泳譜圖。

表5 不同SSR引物對10個釀酒葡萄品種的擴增產(chǎn)物片段大小及賦值標(biāo)準(zhǔn)Table 5 Alleles size range amplified of 10 Vitis vinifera varieties by SSR and encoded standard

圖2 部分釀酒葡萄品種在熒光標(biāo)記VrZAG79位點上的毛細(xì)管電泳圖譜Fig.2 Capillary electrophoresis of VrZAG79 loci for some Vitis vinifera varieties

3 討論與結(jié)論

隨著分子標(biāo)記技術(shù)和基因測序技術(shù)的快速發(fā)展，隨機擴增片段多態(tài)性(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP) 、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP) 、SSR、簡單序列重復(fù)區(qū)間(inter-simple sequence repeat, ISSR)和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)等分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于物種的起源、演化以及遺傳變異等相關(guān)研究，在水稻[21]、大麥[22]、玉米[23]、苦瓜[24]、杏[25]、桃[26]等許多材料上均有報道。相對于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)標(biāo)記技術(shù)，分子標(biāo)記技術(shù)對物種的親緣關(guān)系進行分析更加直接準(zhǔn)確。SSR標(biāo)記是一種共顯性分子標(biāo)記，其檢測所需DNA量少，且耗時短，多態(tài)性好，重復(fù)性好，信息量大，能夠高效精準(zhǔn)地對親緣關(guān)系相對較近的品種或個體進行分析鑒定，從而在葡萄種質(zhì)遺傳多樣性分析，葡萄品種資源保護鑒定和DNA指紋圖譜構(gòu)建等方面得到了較廣泛的應(yīng)用。但應(yīng)用 SSR標(biāo)記進行紅白釀酒葡萄品種間的遺傳多樣性和指紋圖譜建立研究相對較少，同時由于釀酒葡萄種質(zhì)的親緣關(guān)系較近，仍有很多優(yōu)良種質(zhì)未得到評價與鑒定。本研究特選取紅白釀酒葡萄品種進行品種間遺傳多樣性分析和分子身份證的建立[27]。

種質(zhì)資源的遺傳多樣性能夠反映個體在特定生長環(huán)境下基因的豐富程度，是品種種質(zhì)研究工作中的基礎(chǔ)，因此品種間親緣關(guān)系分析和指紋圖譜構(gòu)建對于品種選育，鑒定和保護有重要意義[28]。郭印山等人利用49對SSR引物對20 份葡萄材料進行了親緣關(guān)系分析，研究數(shù)據(jù)顯示，遺傳相似系數(shù)為0.672時，所有葡萄品種分為3大類群。第1大類包括2份歐美雜種和1份美洲種；第2大類為8份歐亞種葡萄品種；第三大類包括2份山歐雜種和2份山葡萄品種[29]。董志剛等人采用SSR標(biāo)記技術(shù)對15份葡萄種質(zhì)進行了聚類分析，結(jié)果顯示，將其分成兩大類，第1大類是山歐雜種，第2大類是歐亞種和歐美雜種[30]。由以上前人研究結(jié)果可見，歐亞種和美洲種這2個葡萄種質(zhì)類群的親緣關(guān)系相對較近，而山葡萄與二者親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。本試驗以10個紅白釀酒葡萄品種為試材，利用SSR標(biāo)記探討紅白釀酒葡萄品種的親緣關(guān)系，聚類分析結(jié)果顯示，所有試驗釀酒葡萄品種親緣關(guān)系較近，在遺傳相似系數(shù) 0.73處產(chǎn)生了分離，將所有樣品分成 2類，第1大類包含所有紅葡萄品種，第2大類包含所有白葡萄品種。其中小芒森聚為第1大類，原因可能是其親本之一為紅葡萄品種。

利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建葡萄品種的 DNA 指紋圖譜，可為保護優(yōu)良葡萄品種種質(zhì)資源、鑒定和檢測葡萄品種及其葡萄酒真實性和純度提供了客觀科學(xué)的參考依據(jù)。DNA指紋圖譜分析常用的方法為特征譜帶法和引物組合法，兩者結(jié)合則大大提高了鑒別效率。成冰等人利用14對SSR引物對13個釀酒白葡萄品種進行擴增，結(jié)果顯示特異性條帶率為25.00%，其中，VrZAG79條帶總數(shù)，多態(tài)性條帶和特異性條帶均為最多，且所有品種的遺傳差異性較大。2個引物VrZAG62和VVIb66可分別鑒定所有試驗品種[31]。杜晶晶等人利用9對引物對80份葡萄種質(zhì)資源進行分子身份證編碼，并能夠區(qū)分所有品種，表明 SSR 標(biāo)記技術(shù)可以高效鑒定葡萄品種[19]。尹玲等人對國內(nèi)24個新葡萄品種，利用6對SSR熒光標(biāo)記引物進行毛細(xì)管電泳，能夠明確區(qū)分所有供試品種，并建立其指紋圖譜[20]。本試驗利用6對SSR引物對10個紅白釀酒葡萄品種進行等位基因賦值并構(gòu)建了供試材料的分子身份證編碼，其中，10個品種均有特征性引物，VVS2是7個品種的特征性引物。同時篩選出5對多態(tài)性高，穩(wěn)定性好的SSR引物熒光標(biāo)記并進行毛細(xì)管電泳，得出10個釀酒葡萄品種的SSR標(biāo)記的熒光圖譜。

本試驗利用12對SSR引物對10個釀酒葡萄品種進行了遺傳多樣性研究，由親緣關(guān)系遠(yuǎn)近將其分成2個類群。并依據(jù)所有樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，選用6對引物對所有試驗材料進行了分子身份證編碼，研究表明 SSR標(biāo)記從分子水平上解析了紅白釀酒葡萄品種的遺傳多樣性，一定程度上對釀酒葡萄品種選育，鑒定和保護有重要意義。同時，采用了5＇-FAM熒光標(biāo)記 SSR引物和毛細(xì)管電泳技術(shù)，最終得出的10個釀酒葡萄品種的SSR熒光圖譜，有利于豐富國際葡萄品種數(shù)據(jù)庫，也對葡萄品種及其葡萄酒真實性和純度的檢測提供了參考依據(jù)。