陳日檬,梁鳳蘭,馬德運(yùn),李 蔚,顏月娥,楊建芳
(1.湛江市食品藥品檢驗(yàn)所,廣東 湛江 524022;2.肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,廣東 肇慶 526061;3.肇慶學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,廣東 肇慶 526061;4.哈爾濱工業(yè)大學(xué)后勤集團(tuán),黑龍江 哈爾濱 150006)
《中國(guó)藥典》(2015版第二部)規(guī)定滴眼液只需進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè),而無(wú)菌檢測(cè)僅局限于檢查樣本中存在的活體菌株,對(duì)死亡細(xì)菌釋放出的內(nèi)毒素檢測(cè)未做規(guī)定.眼睛作為人體極為敏感的部位,如果存在創(chuàng)傷面或者處于發(fā)炎狀況,那么滴眼液中可能存在的內(nèi)毒素就會(huì)通過(guò)傷口進(jìn)入人體血液.研究顯示人體對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素極為敏感:極微量(1 kg體質(zhì)量中含1~5 ng)內(nèi)毒素就能引起體溫上升,發(fā)熱反應(yīng)持續(xù)約4 h后逐漸消退.內(nèi)毒素引起發(fā)熱反應(yīng)的原因是內(nèi)毒素作用于體內(nèi)的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等,使之產(chǎn)生白細(xì)胞介素1、6和腫瘤壞死因子α等細(xì)胞因子,這些細(xì)胞因子作用于宿主下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞,促使體溫升高發(fā)熱.當(dāng)進(jìn)入人體的細(xì)菌內(nèi)毒素超過(guò)一定劑量,可引發(fā)嚴(yán)重的內(nèi)毒素血癥,嚴(yán)重者可造成休克死亡[1].滴眼液生產(chǎn)采用了無(wú)菌生產(chǎn)工藝,一般通過(guò)過(guò)濾方式去除了活體菌株,但無(wú)法去除可能存在的內(nèi)毒素,從而極有可能使存在創(chuàng)傷面或者處于發(fā)炎狀態(tài)的眼睛受到感染.但目前滴眼液內(nèi)毒素檢測(cè)未設(shè)立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),因此有必要建立滴眼液中細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法.研究采用鱟試劑凝膠法對(duì)氧氟沙星滴眼液細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢測(cè),為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供參考方法與標(biāo)準(zhǔn),從而有效保證滴眼液產(chǎn)品的安全性.
BET-16M細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司),ZH-2 BLENDER旋渦混勻器(廣州易測(cè)儀器有限公司),MX-S可調(diào)試混勻器(廣州易測(cè)儀器有限公司),GR-246熱空氣消毒箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司),SW-CJ系列潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司).
細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(凍干)(中國(guó)食品藥品檢定研究所,批號(hào):150601-201176,規(guī)格:100 EU/支),鱟試劑(湛江博康海洋生物有限公司,批號(hào):1302180、1406270,靈敏度:0.25 EU/mL),細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(湛江博康海洋生物有限公司,批號(hào):1408060),堿性調(diào)節(jié)劑(湛江博康海洋生物有限公司,批號(hào):1405270,規(guī)格:2 mL/支).
氧氟沙星滴眼液(江蘇克勝藥業(yè)有限公司,批號(hào):130303),氧氟沙星滴眼液(參天制藥(中國(guó))有限公司,批號(hào):130306),氧氟沙星滴眼液(江蘇亞邦?lèi)?ài)普森藥業(yè)有限公司,批號(hào):130311).
實(shí)驗(yàn)環(huán)境:SW-CJ系列潔凈工作臺(tái),實(shí)驗(yàn)溫度:37±1°C,反應(yīng)時(shí)間:1 h.
用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水)溶解細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(WES),用旋渦混勻器將WES混勻15 min制成內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度為0.5、0.25、0.125和0.0625 EU/mL,每稀釋一步都必須混勻30 s,并以BET水作為陰性對(duì)照.
2.1.1 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制
按圖1 所示操作流程,制成2.0 λ (0.5 EU/mL)、1.0 λ (0.25 EU/mL)、0.5 λ (0.125 EU/mL)、0.25 λ (0.062 5 EU/mL)的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液.
圖1 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)溶液配制流程
2.1.2 檢測(cè)操作與結(jié)果
取不同批號(hào)的鱟試劑各18支,分別加入BET水0.1 mL溶解,其中每批鱟試劑各取16支分別加入上述4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL,每個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4支,另2支加入0.1 mL檢查用水作為陰性對(duì)照,結(jié)果見(jiàn)表1.
表1 靈敏度復(fù)核結(jié)果
靈敏度計(jì)算公式:鱟試劑靈敏度的測(cè)定值λc=lg-1(∑X/4).
由表1結(jié)果可見(jiàn),最大的濃度2λ均為陽(yáng)性,最低的濃度0.25λ均為陰性,陰性對(duì)照為陰性,試驗(yàn)有效[2].計(jì)算2批鱟試劑的靈敏度都為0.149,處于0.5~2λ(0.125~0.5 EU/mL)范圍之間,則該2批鱟試劑可用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè).
《中國(guó)藥典》(2015版第四部)通則規(guī)定了細(xì)菌內(nèi)毒素限值的品種為注射液,而滴眼液作為細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)新品種在藥典上并沒(méi)有明確規(guī)定,故在此參照氧氟沙星原料藥細(xì)菌內(nèi)毒素限值,每1 mg樣品細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)小于0.75 EU[3],則氧氟沙星滴眼液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L為0.75 EU/mg.
按照公式MVD=L*C/λ且本品的標(biāo)示量為5 mL,供試品濃度為3 g/L,λ為0.25 EU/mL.計(jì)算可得9倍為氧氟沙星滴眼液供試品的最大有效稀釋倍數(shù)(MVD).
用BET水作為稀釋液,將氧氟沙星滴眼液分別稀釋成9、7、5、3、1倍的系列濃度,再以各稀釋倍數(shù)濃度的供試液將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(WES)制成內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0.5、0.25、0.125和0.062 5 EU/mL,加入鱟試劑混合,進(jìn)行抑制試驗(yàn).
2.4.1 氧氟沙星滴眼液樣品稀釋液制備
取樣品和檢查用水各1 mL混勻,制成1:1溶液,然后取1:1溶液的1 mL加入檢查用水0.5 mL制成1:3溶液,然后取1:3溶液的1 mL加入檢查用水0.7 mL制成1:5溶液,再取1:5溶液的1 mL加入檢查用水0.4 mL制成1:7溶液,最后取1:7溶液的1 mL加入檢查用水0.3 mL制成1:9溶液.
2.4.2 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備
細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備的操作按照2.1.1方法.
2.4.3 檢測(cè)
每一濃度的稀釋液分別取鱟試劑各18支,分別以0.1 mL檢查用水加入于其中16支,溶解,分別加入0.1 mL相應(yīng)濃度(1、3、5、7、9倍)的供試品稀釋液,每個(gè)內(nèi)毒素濃度分別平行做4支;另外2支分別加入0.1 mL相應(yīng)濃度的稀釋液作為陰性對(duì)照,結(jié)果見(jiàn)表2.
表2 供試品的干擾初篩結(jié)果
如表2所示,供試品原液對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)z呈抑制,供試品稀釋5倍時(shí),符合當(dāng)最大濃度2 λ均為陽(yáng)性,最低濃度0.25 λ均為陰性,陰性對(duì)照為陰性,試驗(yàn)視為有效的規(guī)定.故樣品稀釋至5倍以上時(shí)實(shí)驗(yàn)不產(chǎn)生干擾,可用做正式干擾試驗(yàn).
用5倍樣品稀釋液和BET水分別將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(WES)制成內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度為0.5、0.25、0.125和0.0625 EU/mL,分別以2批鱟試劑(λ為0.25EU/mL)進(jìn)行干擾試驗(yàn).
2.5.1 氧氟沙星滴眼液的5倍稀釋液的制備
按照2.4.1方法操作.
2.5.2 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備
按照2.1.1方法操作.
2.5.3 檢測(cè)
取2批號(hào)鱟試劑各36支,加入BET水0.1 mL溶解,分別加入0.1 mL 5倍樣品稀釋液制成的4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液于其中16支,實(shí)驗(yàn)平行做4支,另取2支分別加入5倍樣品稀釋液0.1 mL作為供試品陰性對(duì)照;再另取16支分別加入0.1 mL BET水制成的4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,陰性對(duì)照為剩余2支加0.1 mL BET水的反應(yīng)管,結(jié)果見(jiàn)表3.
表3 供試品的正式干擾結(jié)果
2.5.4 計(jì)算
2批鱟試劑BET水系列溶液和5倍樣品稀釋液系列溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度幾何平均值(Es和Et1、Et2)為
同上計(jì)算,鱟試劑批號(hào):1302180,Et1=0.149 EU/mL;鱟試劑批號(hào):1406270,Et2=0.177 EU/mL.
根據(jù)《中國(guó)藥典》(2015版第四部)通則規(guī)定,當(dāng)Es在0.5~2.0 λ范圍內(nèi),且Et也均在0.5~2.0Es范圍內(nèi)(包括0.5Es和2.0Es),則認(rèn)為供試品在該濃度下無(wú)干擾.由上述計(jì)算結(jié)果可見(jiàn),Es=0.149在0.5~2.0 λ(即 0.125~0.5 EU/mL)范圍內(nèi),Et1=0.149、Et2=0.177也均在 0.5~2.0Es(即0.074 325~0.297 302EU/mL)范圍內(nèi),則實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾,即5倍的樣品稀釋液可以用于樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限度檢測(cè).
取3批不同批號(hào)氧氟沙星滴眼液樣品,分別用BET水稀釋5倍,采用2批不同批號(hào)鱟試劑對(duì)樣品稀釋液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè),從而確立氧氟沙星滴眼液中細(xì)菌內(nèi)毒素限度分析方法.實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下:
2.6.1 制備5倍樣品稀釋液
依照供試品的正式干擾試驗(yàn)項(xiàng)下樣品稀釋操作.
2.6.2 內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備
2.6.3 檢測(cè):
分別取2批鱟試劑各8支,分別加入0.1 mL檢查用水溶解,其中2支管平行加入其中一個(gè)樣品稀釋液0.1 mL,2支管平行加入供試品陽(yáng)性溶液0.1 mL作為陽(yáng)性對(duì)照,2支管平行加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為陽(yáng)性,最后2支管平行加入檢查用水0.1mL作為陰性.同法測(cè)定另外兩批樣品,結(jié)果見(jiàn)表4.
從表4可見(jiàn),供試品陽(yáng)性對(duì)照管(PPC)和陽(yáng)性對(duì)照管(PC)均為陽(yáng)性,陰性對(duì)照管NC均為陰性,試驗(yàn)有效.供試品(S)管均為陰性,表明氧氟沙星滴眼液樣品中未檢測(cè)出細(xì)菌內(nèi)毒素,3批氧氟沙星滴眼液樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素均符合規(guī)定.
表4 氧氟沙星滴眼液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果
在內(nèi)毒素凝膠法檢測(cè)中,通過(guò)干擾試驗(yàn)得出5倍樣品稀釋濃度是可以排除干擾的,說(shuō)明細(xì)菌內(nèi)毒素鱟試劑凝膠法能用于氧氟沙星滴眼液樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè).由細(xì)菌內(nèi)毒素鱟試劑凝膠法檢查結(jié)果可見(jiàn),氧氟沙星滴眼液樣品中未檢測(cè)出細(xì)菌內(nèi)毒素,3批不同氧氟沙星滴眼液樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素均符合規(guī)定,故鱟試劑凝膠法可應(yīng)用于氧氟沙星滴眼液細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè).
本實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程簡(jiǎn)便、快速、靈敏,可靠性高,鱟試劑凝膠法可作為滴眼液的內(nèi)毒素檢測(cè)手段,可供相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)對(duì)滴眼液的質(zhì)量控制,保證產(chǎn)品的安全性.