荊勝利，張 坤，黃小燕，張 麗，黃 斌*

(信陽師范學(xué)院a.生命科學(xué)學(xué)院；b.大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院，河南 信陽 464000)

0 引言

黃緣閉殼龜(Cuoraflavomarginata)，別名為黃緣盒龜、斷板龜、夾蛇龜、黃板龜，隸屬于龜科、閉殼龜屬，也有學(xué)者將其歸為盒龜屬[1,2]，起源于中國，日本琉球群島有分布[3]. 在我國主要分布于河南、安徽、臺(tái)灣等地，其集中分布區(qū)位于河南與安徽交界的大別山區(qū)與皖南山區(qū)[2,4]. 黃緣閉殼龜是一個(gè)具有“活化石”之稱的古老物種[5]，其不僅在動(dòng)物系統(tǒng)演化上具有重要的學(xué)術(shù)研究價(jià)值，而且也是龜類中的珍品，具有極高的藥用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值. 由于黃緣閉殼龜具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，大量野生資源被販賣與捕殺，加上自然環(huán)境條件的惡化[6-8]，造成了我國野生黃緣閉殼龜?shù)臄?shù)量已極為稀少，頻臨滅絕. 為此，黃緣閉殼龜被世界自然保護(hù)聯(lián)盟( IUCN)及瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約( CITES) 列為珍稀瀕危物種[9,10]，同時(shí)被我國定為具有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究價(jià)值的陸生野生保護(hù)動(dòng)物，還被河南、安徽等省列為省級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物[4,11]. 目前，對黃緣閉殼龜?shù)难芯恐饕性诜敝澈捅碛^形態(tài)學(xué)及行為學(xué)等方面[12-15]. 在分子生物學(xué)方面，主要進(jìn)行黃緣閉殼龜線粒體基因組序列測定與比較研究工作[2,4]，而開發(fā)黃緣閉殼龜核基因組分子標(biāo)記并進(jìn)行遺傳多樣性研究工作尚未見報(bào)道. 因此，從分子遺傳學(xué)角度建立黃緣閉殼龜?shù)挠行ПＷo(hù)機(jī)制顯得尤為迫切.

在核基因組分子標(biāo)記中，微衛(wèi)星因具有高度多態(tài)性、呈共顯性遺傳、易檢測、分布均勻等特點(diǎn)，成為遺傳多樣性檢測、群體遺傳學(xué)研究、群體演化或進(jìn)化研究、親緣關(guān)系分析和人工增值放流效果評(píng)價(jià)等諸多領(lǐng)域中一類重要的分子標(biāo)記[16-18]. 目前，微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)在揚(yáng)子鱷[19]、大熊貓[20]和東北虎[21]等瀕危動(dòng)物遺傳保護(hù)方面得到了廣泛的應(yīng)用. 由于黃緣閉殼龜基因組序列匱乏，尚未見微衛(wèi)星分子標(biāo)記的研究報(bào)道. FIASCO法[22]是一種高效、快捷、低成本分離微衛(wèi)星序列的方法. 它可以直接從基因組DNA酶切產(chǎn)物中富集微衛(wèi)星序列，無須知道研究物種基因組序列信息，此方法已廣泛用于東方白鸛[23]、小熊貓[24]、拉步甲[25]、烏蘇里擬鱗[26]和巴東木蓮[27]等多種瀕危動(dòng)植物的微衛(wèi)星分子標(biāo)記開發(fā)研究中. 鑒于此，F(xiàn)IASCO法是分離黃緣閉殼龜微衛(wèi)星分子標(biāo)記的最佳選擇.本研究采用FIASCO法開發(fā)黃緣閉殼龜?shù)奈⑿l(wèi)星分子標(biāo)記并對人工馴養(yǎng)繁殖的群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在為黃緣閉殼龜群體的遺傳保護(hù)提供一個(gè)有力的分子工具，并為正確評(píng)價(jià)與合理保護(hù)該瀕危物種提供科學(xué)的理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的黃緣閉殼龜材料主要來自于信陽大別山特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖合作社，此合作社飼養(yǎng)的種龜主要來源于信陽大別山地區(qū)的黃緣閉殼龜. 本研究中所有黃緣閉殼龜材料都是非人為因素引起自然死亡的一齡仔龜個(gè)體，浸泡于95%酒精中并-80 ℃保存.

1.2 基因組DNA提取

黃緣閉殼龜基因組DNA提取所使用的是改進(jìn)的CTAB法[28]. 具體提取過程是：從95%酒精浸泡的黃緣閉殼龜腿部剪取200 mg左右肌肉組織并置于1.5 mL離心管中，然后加入無菌的0.9% NaCl溶液，浸泡12 h，期間每3 h更換溶液1次. 取浸泡處理后的肌肉組織于新離心管中，充分剪碎后加入600 μL 2%的CTAB裂解液，并放置于56 ℃水浴鍋中溫浴過夜. 裂解完畢后，加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，反復(fù)顛倒混勻，12 000 r/min離心15 min；吸取上清，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，反復(fù)顛倒混勻，12 000 r/min離心15 min；吸取上清，加入2倍體積的無水乙醇(-20 ℃預(yù)冷)，顛倒混勻后放入-20 ℃冰箱中；1 h后取出12 000 r/min離心10 min，倒掉上清，加入500 μL75%的乙醇，脫鹽和洗滌沉淀2次，置于空氣中自然干燥；晾干后加入50 μLTE溶解DNA，存于-20 ℃?zhèn)溆?

1.3 微衛(wèi)星富集文庫構(gòu)建

1.3.1 基因組DNA酶切與接頭連接

用限制性內(nèi)切酶MseI對黃緣閉殼龜基因組DNA進(jìn)行酶切. 酶切反應(yīng)總體系為20 μL，其中包含有400 ng的黃緣閉殼龜基因組DNA，5U的MseI限制性內(nèi)切酶，2 μL的10×NEB Buffer，去離子水補(bǔ)充至20 μL. 37 ℃酶切15 min，酶切后65 ℃溫浴20 min使內(nèi)切酶失活.

酶切產(chǎn)物與MseI接頭(接頭序列分別為：MseI-A 5’-TACTCAGGACTCAT-3’和MseI-B 5’- GACGATGAGTCCTGAG-3’)進(jìn)行連接，獲得含有接頭的酶切產(chǎn)物.

連接反應(yīng)體系為10 μL，其中Solution I 5 μL，酶切產(chǎn)物3.5 μL，MseI接頭1.5 μL，然后16 ℃連接4 h.

1.3.2 預(yù)擴(kuò)增

預(yù)擴(kuò)增使用的引物MseI -N的序列為5’- GATGAGTCCTGAGTAAN -3’，其中N 代表A，G，C和T四種不同的堿基. 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：0.5 μL的連接產(chǎn)物，4×0.5 μL的引物MseI -N，1.6 μL 的dNTP，2U的rTaq酶，1倍的PCR緩沖液，加去離子水補(bǔ)充至20 μL. 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)梯度分別為9、11、14、17、20、23和27，72 ℃延伸7 min. 擴(kuò)增完畢后取部分產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖膠電泳檢測擴(kuò)增片段大小的分布情況和擴(kuò)增產(chǎn)物的含量. 若符合預(yù)期要求，則用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收剩余擴(kuò)增產(chǎn)物.

1.3.3 富集文庫構(gòu)建與篩選

生物素探針與靶標(biāo)片段的雜交：用純化回收的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物與生物素探針(AG)13進(jìn)行雜交，100 μL的雜交體系包含：預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物25 μL，5’-bio-(AG)13探針5 μL，雜交液(6×SSC+0.1%SDS)70 μL. 充分混勻后95 ℃變性10 min，68 ℃復(fù)性1 h，自然冷卻至室溫. 最后在雜交體系中加入300 μL TEN100溶液.

磁珠富集微衛(wèi)星DNA片段：首先，用TEN100溶液清洗鏈霉親和素磁珠3次，每次5 min. 接著將磁珠與雜交混合物進(jìn)行反應(yīng)，從而使磁珠上的鏈霉親和素與生物素結(jié)合. 此過程需要室溫放置30 min，期間不停輕輕攪動(dòng)吹打磁珠，使磁珠與探針充分結(jié)合. 再接著是用TEN1000緩沖液常溫下洗滌3次，每次5 min，并不時(shí)吹打. 再用0.2×SSC+0.1%SDS室溫洗滌3次，每次5 min. 最后用80 μL TE重懸磁珠，吹打均勻，固定磁珠，迅速吸取上清保存于1.5 mL離心管中. 為使更多的DNA片段洗脫下來，再加80 μL TE，95 ℃水浴5 min，此過程洗滌2次，上清保存于1.5 mL離心管中備用.

富集片段的克隆與篩選：首先將富集的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，獲得富含微衛(wèi)星的雙鏈DNA，具體操作與預(yù)擴(kuò)增類似. 接著將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中. 最后經(jīng)過菌液PCR，挑取插入片段大小300～800 bp之間的單克隆送到南京金斯瑞公司測序.

1.4 序列分析與引物設(shè)計(jì)

測序所得序列用BLAST比對去除載體序列，再用SSRIT軟件(設(shè)置參數(shù)為: 微衛(wèi)星基序的堿基數(shù)2～6 bp，重復(fù)序列的長度不小于12 bp)查找包含微衛(wèi)星的序列. 最后，根據(jù)微衛(wèi)星序列側(cè)翼區(qū)的保守序列，利用BatchPrimer 3.0[29]設(shè)計(jì)引物，并將所設(shè)計(jì)成功的引物序列送南京金斯瑞公司合成.

1.5 基因型分析

利用大別山特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖合作社的32個(gè)黃緣閉殼龜人工馴養(yǎng)繁殖群體對新開發(fā)的SSR分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得基因型數(shù)據(jù). PCR擴(kuò)增體系為：2×Power Taq PCR MasterMix 5 μL，兩條引物分別為0.2 μL，基因組DNA為1.1 μL，無菌去離子水為3.5 μL. PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋菏紫?4 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s和72 ℃延伸30 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min. 用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離與統(tǒng)計(jì)分析. 在10 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入8 μL的上樣緩沖液，然后取3 μL變性過的擴(kuò)增產(chǎn)物混合液在6%變性聚丙烯酞胺凝膠上電泳分離，電泳功率恒定在60 W，電泳時(shí)間通常在1 h左右，具體時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增片段的實(shí)際大小而決定，接著用銀染法[30]進(jìn)行顯示，最后判讀片段大小并照相記錄. 擴(kuò)增片段大小是以pBR322DNA/MspI 標(biāo)準(zhǔn)分子Marker(北京天根)為參照進(jìn)行判讀.

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用PowerMarker[31]軟件對多態(tài)性SSR位點(diǎn)的等位基因數(shù)目(number of alleles，nA)，觀測雜合度(observed heterozygosity，Ho)和期望雜合度(expected heterozygosity，He)進(jìn)行計(jì)算分析. 用軟件Arlequin 3.1[32]分析每個(gè)位點(diǎn)的哈代-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)的偏離情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星富集文庫構(gòu)建

采用CTAB法對黃緣閉殼龜肌肉組織進(jìn)行DNA提取，經(jīng)過電泳和紫外分光光度計(jì)檢測表明獲得了高質(zhì)量基因組DNA(圖1 A). 然后，用MseI內(nèi)切酶將黃緣閉殼龜基因組DNA進(jìn)行酶切，酶切后DNA呈現(xiàn)彌散狀且集中分布于300～1000 bp之間(圖1 A). 接著，在酶切產(chǎn)物上加上人工接頭，并進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，結(jié)果表明14個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物適合用于富集文庫構(gòu)建(圖1 B). 最后，用(AG)13生物素探針與預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交與洗脫后富集大量含有微衛(wèi)星序列的DNA片段，再經(jīng)過連接轉(zhuǎn)化后成功構(gòu)建黃緣閉殼龜微衛(wèi)星富集文庫.

圖1 黃緣閉殼龜基因組DNA的酶切產(chǎn)物(A)與預(yù)擴(kuò)增檢測(B).Fig. 1 The product of digestion reaction with genomic DNA of yellow-margined box turtle (A) and the tests of the pre-amplification reaction (B)注：A圖中，1.基因組DNA，2.Mse I酶切產(chǎn)物；M.DL2000bp DNA ladder. B圖中，9、11、14、17、20、23與27.預(yù)擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)；M.DL2000bp DNA ladder

2.2 測序結(jié)果及序列分析

從富集文庫中隨機(jī)挑選 144個(gè)白色單克隆，菌液PCR檢測結(jié)果(圖2，部分菌液PCR檢測結(jié)果)表明81(56.3%)個(gè)為含有插入片段大小符合要求的陽性克隆. 在這些測序的陽性克隆序列中，55(67.9%)個(gè)克隆含有微衛(wèi)星基序序列重復(fù)數(shù)目大于5的序列.

圖2 陽性克隆的檢測. Fig. 2 The testing of the post clonies. 注：1～24.隨機(jī)挑選的24個(gè)克?。籑.DL2000bp DNA ladder

在55個(gè)序列中，含有二核苷酸微衛(wèi)星基序的序列有 51個(gè)(92.7%)，其中有41個(gè)是以AG/TC為重復(fù)基序的序列，占總二核苷酸重復(fù)基序的80.4%，此結(jié)果表明本研究構(gòu)建的富集文庫中包含更多與探針(AG)13相符的微衛(wèi)星序列. 在剩余的序列中，有2個(gè)四核苷酸基序，有1個(gè)五核苷酸基序，有1個(gè)六核苷酸基序. 最終，根據(jù)這些序列成功設(shè)計(jì)并合成了55對引物.

2.3 多態(tài)性標(biāo)記篩選與遺傳多樣性分析

首先以3個(gè)隨機(jī)挑選的黃緣閉殼龜個(gè)體DNA為模板對55對引物進(jìn)行初步篩選擴(kuò)增，結(jié)果有33對引物能夠擴(kuò)增出特異性條帶. 再用這些引物對來源于養(yǎng)殖場的32個(gè)黃緣閉殼龜基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性分析，去除單態(tài)性和擴(kuò)增條帶不佳的引物，最終18對引物(標(biāo)記)具有較好的多態(tài)性. 對18個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在養(yǎng)殖場群體中的等位基因數(shù)、期望雜合度和觀測雜合度及哈代博格平衡偏離情況(HWE)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(表 1)中，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目為2～14個(gè)不等，平均每個(gè)位點(diǎn)有6.3個(gè)等位基因；期望雜合度在0.148和0.903之間變化(平均值為0.635)，觀測雜合度在0.032和0.936之間變化(平均值為0.329). 在哈代溫格博格平衡(HWE)檢測中，經(jīng)過Bonferroni修正(Bonferroni Correction ，P< 0.05/18=0.003)后發(fā)現(xiàn)13位點(diǎn)均偏離了哈代溫格博格平衡(HWE). 究其原因，可能是選用分析的群體為養(yǎng)殖場的人工群體引起的. 由于黃緣閉殼龜自然群體材料獲取十分困難，因此，只能采用人工繁育群體進(jìn)行研究. 此外，為了更好地保護(hù)黃緣閉殼龜不被傷害，本研究樣品均是來源于養(yǎng)殖場養(yǎng)殖過程中自然死亡的個(gè)體，會(huì)影響到群體的遺傳構(gòu)成. 再加上近親交配與無效等位基因的存在也會(huì)在一定程度上影響著哈代溫格博格平衡的偏離.

表1 黃緣閉殼龜18個(gè)開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記特征Tab. 1 Characteristics of 18 microsatellite markers developed inC. flavomarginata

續(xù)表1

注：HO: 觀測雜合度; He: 預(yù)期雜合度; Na: 每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目; D: 偏離哈代溫伯格平衡情況; NS: 無偏離平衡的位點(diǎn); *: 用Bonferroni 修正后(P<0.003)嚴(yán)重偏離哈代溫伯格平衡的位點(diǎn)

3 討論

在本研究中，采用FIASCO法構(gòu)建了以(AG)13為探針的富集文庫，并且此文庫的微衛(wèi)星序列富集效率達(dá)到67.9%，說明黃緣閉殼龜基因組富含微衛(wèi)星序列，且文庫構(gòu)建效果較好.

遺傳多樣性保護(hù)是物種保護(hù)的核心問題，評(píng)估物種種群遺傳多樣性的兩個(gè)重要參數(shù)分別是等位基因數(shù)與雜合度[33]. 在本研究中，18個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記的平均等位基因數(shù)為6.3，平均期望雜合度為0.635，平均觀測雜合度為0.329，說明黃緣閉殼龜人工馴養(yǎng)繁殖群體的遺傳多樣水平較低，這可能是由于在人工繁殖過程中較少個(gè)體之間的近交現(xiàn)象引起. 與黃喉擬水龜4個(gè)種群的遺傳多樣性[34](等位基因數(shù)為7～43，平均期望與觀測雜合度分別為0.726～0.786和0.627～0.695)相比，黃緣閉殼龜?shù)倪z傳多樣性水平更低. 這與兩種爬行動(dòng)物的瀕危程度是密切相關(guān)，黃緣閉殼龜是國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物[8]，而黃喉擬水龜僅是國家保護(hù)的有益的或者有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究價(jià)值的陸生野生動(dòng)物名錄中的一種保護(hù)動(dòng)物. 此外，本研究中所收集的實(shí)驗(yàn)材料是人工繁殖群體養(yǎng)殖過程中自然死亡的仔龜，而非隨機(jī)抽樣的個(gè)體，造成不能囊括群體的所有遺傳變異，而致使遺傳多樣性較低.

本研究對大別山特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖合作社的黃緣閉殼龜群體進(jìn)行的遺傳多樣分析初步反映了大別山地區(qū)群體的基因遺傳多樣性的現(xiàn)狀. 目前，從形態(tài)上可以將黃緣閉殼龜分為大別山種群、臺(tái)灣種群[4]、華中種群以及華南種群[14]，然而在分子水平上對不同種群的遺傳結(jié)構(gòu)研究報(bào)道較少，尚不了解各個(gè)地理種群的遺傳分化、進(jìn)化歷史、遺傳多樣性等信息，從而給黃緣閉殼龜保護(hù)單元的劃分及種群保護(hù)帶來了困難. 為了更好地保護(hù)該瀕危物種，開展其種群遺傳結(jié)構(gòu)與分子遺傳多樣性研究尤為迫切. 因此，本研究開發(fā)的黃緣閉殼龜微衛(wèi)星分子標(biāo)記，將為該瀕危物種的地理種群劃分及遺傳保護(hù)提供一種重要的分子工具，此外，基于此類標(biāo)記的遺傳多樣性分析將為該物種的人工繁育、自然種群重建提供理論依據(jù).