鄭 皓，景嘉楠，李鐵鵬，夏 鑫，軒 閣，董子明

(1.鄭州大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，河南 鄭州 450001；2.河南省腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008；3.鄭州大學 公共衛(wèi)生學院，河南 鄭州 450001；4.生物芯片上海國家工程研究中心，上海，201203)

0 引言

細胞周期分為G1、S、G2和M期，細胞周期由細胞周期素(Cyclins)、細胞周期素依賴性激酶(Cyclin Dependent Kinases, CDKs)、細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白(Cyclin Dependent Kinase Inhibitor, CDKI)共同調(diào)節(jié)[1-3].細胞呈現(xiàn)自主且無節(jié)制的增殖，即細胞周期調(diào)節(jié)失控可以導致腫瘤的發(fā)生[4-6].食管癌(Esophageal Cancer, EC) 在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第8位，死亡率居第6位[7,8].我國是世界上食管癌高發(fā)國家，每年食管癌新發(fā)病例超過22萬例，死亡超過20萬例[9].人類CDK16基因定位于染色體Xp11.23.由CDK16基因編碼的細胞周期素依賴性激酶16 (Cyclin Dependent Kinase 16, CDK16)也被稱為PCTAIRE1或PCTK1[10].CDK16是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可在終末分化細胞的信號轉(zhuǎn)導通路中，以及在胞吐分泌和分泌型蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上運輸?shù)倪^程中發(fā)揮作用[11-13].

研究表明，細胞周期素依賴性激酶16(Cyclin Dependent Kinase 16, CDK16)在多種腫瘤中高表達，并在腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移以及凋亡的過程中發(fā)揮著重要的作用[14-17].對食管鱗癌的診斷標志物已經(jīng)有一些研究[18]，但是CDK16在食管癌中的表達情況目前尚不明晰.食管癌患者預后差，死亡率高[19].因此研究CDK16在食管癌中的表達及臨床病理意義，可為闡明CDK16參與食管癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，以及為食管癌的診斷和防治提供新的依據(jù).另外使用組織芯片技術(shù)可以同時研究某個蛋白在幾十個或上百個病例樣本中的表達.由于實驗條件一致，可以最大限度地降低實驗誤差，提高實驗結(jié)果的可信度[20,21].

本研究利用組織芯片研究CDK16在各類型食管癌(鱗癌、基底細胞樣鱗癌、梭形細胞鱗癌、腺癌、腺鱗癌、未分化癌)以及15例原發(fā)型食管鱗癌(每1例包括癌/癌旁/淋巴結(jié)各1點)組織樣本中的表達，以探討CDK16在食管癌中的表達及其臨床病理意義.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 芯片

本次研究中所使用的兩張組織芯片均由生物芯片上海國家工程研究中心(Biochip Shanghai National Engineering Research Center)提供.為了便于研究，分別將這兩張組織芯片命名為hESCC-TMA050和hESCC-TMA045.這兩張組織芯片上所有組織標本點所對應(yīng)的病患在手術(shù)前均未進行過放療或化療，且均具有詳細的臨床病理資料.

編號為hESCC-TMA050的組織芯片上共有50個組織標本點，有5例食管鱗狀細胞癌(癌/癌旁各1點)、8例基底細胞樣鱗狀細胞癌(癌/癌旁各1點)、4例梭形鱗狀細胞癌(2例癌/癌旁各1點)、6例食管腺癌(4例癌/癌旁各1點)、5例食管腺鱗癌(1例癌/癌旁各1點)、1例食管未分化癌(癌/癌旁各1點).所有50個組織標本點均勻的排布于載玻片上，沒有脫片，沒有明顯的位移或扭曲.組織芯片經(jīng)蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin Staining, HE)染色病理診斷證實，并附有HE染色結(jié)果.

編號為hESCC-TMA045的組織芯片上共有45個組織標本點，共包括15例原發(fā)食管鱗狀細胞癌，每例包括癌/癌旁/淋巴結(jié)各1點.45個組織標本點均勻排布于載玻片上，沒有脫片，沒有明顯的位移或扭曲.組織芯片經(jīng)HE染色病理診斷證實，并附有HE染色結(jié)果.

1.1.2 試劑

SP-9000免疫組織化學試劑盒(包括封閉用山羊血清、生物素、標記二抗和辣根酶標記鏈霉卵白素)，北京中杉生物技術(shù)有限公司；DAB顯色液和EnVisionTM試劑盒，福州邁新生物技術(shù)公司，具體操作步驟參照試劑盒說明書；兔抗人CDK16多克隆抗體，英國Abcam公司.

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(Immunohistochemistry, IHC)

首先，進行切片的脫蠟水化，接著用濃度為3%的H2O2封閉切片10 min，然后，將切片放置于pH6.0～6.2的0.1%枸櫞酸緩沖液中微波修復20 min.隨后使用山羊血清封閉切片15 min，最后將切片放置于4 ℃冰箱中一抗過夜.

第二天，從冰箱中取出切片，待切片恢復室溫后，依次加入生物素化的二抗和辣根酶標記鏈霉卵白素，放置于37 ℃的烘箱中孵育30 min.然后依次進行DAB顯色、蘇木素復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后使用中性樹膠封片.

1.2.2 結(jié)果判定

由經(jīng)驗豐富的病理學專家獨立閱片，然后討論分析，最終確定免疫組織化學結(jié)果.CDK16陽性染色以細胞漿或細胞核出現(xiàn)黃色或棕褐色為準.隨機選取10個視野(400×)，每個視野中約含100個腫瘤細胞.采用半定量計分方法判定染色結(jié)果，根據(jù)免疫組化的染色強度和染色細胞所占比例這二者的乘積來判定.

2 結(jié)果

2.1 組織芯片HE染色及IHC染色的有效性

編號為hESCC-TMA050的組織芯片上共有50個組織標本點，經(jīng)HE染色后，殘缺點數(shù)為0，有效信息量為100%；經(jīng)IHC染色后，殘缺點數(shù)為0，有效信息量為100%，見圖1.

編號為hESCC-TMA045的組織芯片上共有45個組織標本點，經(jīng)HE染色后，殘缺點數(shù)為1，有效信息量為97.8%；經(jīng)IHC染色后，殘缺點數(shù)為1，有效信息量為97.8%，見圖1.

圖1 兩張組織芯片的IHC染色結(jié)果及HE染色結(jié)果Fig. 1 IHC staining results and HE staining results of two tissue microarrays

2.2 CDK16在不同類型食管癌中的表達

IHC染色結(jié)果可見，在食管鱗癌中，CDK16為強陽性表達；在食管腺癌中，CDK16弱陽性表達；在食管腺鱗癌中，CDK16中陽性表達；在食管未分化癌中，CDK16強陽性表達，見圖2和圖3.

2.3 CDK16在食管鱗癌及其組織亞型中的表達

食管鱗癌的組織亞型主要包括基底樣食管鱗狀細胞癌和梭形食管鱗狀細胞癌這兩種.在本次研究中，CDK16在食管鱗狀細胞癌中呈現(xiàn)強陽性表達；同時，實驗結(jié)果表明CDK16在食管鱗癌的兩個組織亞型基底樣食管鱗狀細胞癌和梭形食管鱗狀細胞癌中也呈強陽性表達，見圖2.

圖2 CDK16在食管鱗癌及其組織亞型中的表達(原始放大倍數(shù)×200)Fig. 2 Expression of CDK16 in esophageal squamous cell carcinoma and its histological subtypes (Original magnification×200)

圖3 CDK16在其他類型食管癌中的表達(原始放大倍數(shù)×200)Fig. 3 Expression of CDK16 in other types of esophageal cancer (Original magnification×200)

2.4 CDK16在不同分化程度食管鱗癌中的表達

實驗結(jié)果顯示，在食管鱗癌的高分化癌組織中，CDK16呈現(xiàn)弱陽性表達；在食管鱗癌的中分化癌組織中，CDK16為中陽性表達；而在食管鱗癌的低分化癌組織中，CDK16呈強陽性表達，見圖4.

圖4 CDK16在不同分化程度食管鱗癌中的表達(原始放大倍數(shù)×200)Fig. 4 Expression of CDK16 in esophageal squamous cell carcinoma with different degrees of differentiation (Original magnification×200)

2.5 CDK16在不同臨床分期淋巴結(jié)中的表達

在陰性淋巴結(jié)(N0期)中，CDK16呈現(xiàn)為陰性染色，見圖5A；在陽性淋巴結(jié)N1期中，CDK16陽性染色呈弱陽性，見圖5B；在陽性淋巴結(jié)N2期中，CDK16陽性染色為中陽性，見圖5C；在陽性淋巴結(jié)N3期中，CDK16陽性染色為強陽性，見圖5D.

圖5 CDK16在不同臨床分期淋巴結(jié)中的表達(原始放大倍數(shù)×200)Fig. 5 Expression of CDK16 in lymph nodes of different clinical stages (Original magnification×200)

注：A.陰性淋巴結(jié)(N0期),B.陽性淋巴結(jié)N1期,

C.陽性淋巴結(jié)N2期,D.陽性淋巴結(jié)N3期

2.6 CDK16在食管鱗癌細胞及淋巴結(jié)細胞中的定位

免疫組化染色結(jié)果顯示，在食管鱗癌的癌旁組織中，CDK16呈現(xiàn)出陰性染色，CDK16在細胞質(zhì)和細胞核中均未見表達，見圖6A；在食管鱗癌的高分化癌組織中，CDK16在細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，但細胞核中的表達要遠遠的強于在細胞質(zhì)中的表達，見圖6B；在食管鱗癌的中分化癌組織中，CDK16在細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，且表達水平相差不大，見圖6C；在食管鱗癌的低分化癌組織中，CDK16在細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，但在細胞質(zhì)中的表達要強于在細胞核中的表達，見圖6D.在食管鱗癌的陰性淋巴結(jié)(N0期)中，CDK16染色為陰性，在細胞質(zhì)和細胞核中均無表達，見圖6E.在食管鱗癌的陽性淋巴結(jié)中，CDK16陽性表達，且表達強度與腫瘤的臨床分期呈正相關(guān)；另外，在陽性淋巴結(jié)中，CDK16在細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，但以核表達為主，見圖6F～H.

圖6 CDK16在食管鱗癌細胞中的定位(原始放大倍數(shù)×400)Fig. 6 Localization of CDK16 in esophageal squamous cell carcinoma cells (original magnification×400)

注：A.癌旁組織,B.高分化癌組織,C.中分化癌組織,

D.低分化癌組織,E.陰性淋巴結(jié)(N0期),

F.陽性淋巴結(jié)N1期,G.陽性淋巴結(jié)N2期,

H.陽性淋巴結(jié)N3期

3 討論

CDK16在前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤中具有較高的表達，而在這些腫瘤細胞中，研究者通過實驗發(fā)現(xiàn)，RNAi介導的CDK16的基因沉默可以引發(fā)細胞里中心體的動力學缺陷，從而引起有絲分裂的異常，并最終抑制腫瘤細胞生長.另外，研究者還證實腫瘤抑制因子p27可以與CDK16相互作用.體外激酶實驗也表明CDK16可以在Ser10磷酸化p27.沉默CDK16可以調(diào)節(jié)p27的Ser10位點的磷酸化水平，并導致p27在腫瘤細胞中的表達量上升.研究者在宮頸癌HeLa細胞中的機理研究表明CDK16在細胞周期的S期和M期磷酸化p27，在一個小鼠的前列腺癌移植瘤模型中，條件性的沉默CDK16可以恢復p27的蛋白表達并抑制腫瘤生長.這表明，CDK16可以調(diào)節(jié)p27的穩(wěn)定性、有絲分裂和腫瘤的生長，CDK16可以作為一個候選的癌癥治療靶點[22,23].

已有的文獻報道表明，CDK16在卵巢癌、前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌、鼻咽癌中具有較強的表達，并通過影響腫瘤細胞的增殖、侵襲或凋亡等調(diào)控腫瘤的發(fā)生及發(fā)展.但是CDK16是否也參與調(diào)控食管癌的發(fā)病，目前未見有相關(guān)的文獻報道.

本次研究結(jié)果初步揭示了CDK16與食管鱗癌之間的關(guān)系.研究結(jié)果顯示，CDK16的表達與食管癌的組織學類型密切相關(guān).CDK16在食管腺癌及食管腺鱗癌中為弱陽性表達，但在食管鱗癌及其兩個組織亞型基底樣食管鱗狀細胞癌及梭形食管鱗狀細胞癌中則為強陽性表達.具體到食管鱗癌，進一步的研究結(jié)果顯示：CDK16在食管鱗癌中的表達強度與腫瘤的分化程度負相關(guān)，并與食管鱗癌淋巴結(jié)的臨床分期正相關(guān).這提示CDK16與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著緊密的聯(lián)系.

另外，CDK16在食管鱗癌細胞核中的表達強度隨著腫瘤的惡性程度呈依次遞減趨勢，而在細胞質(zhì)中的表達強度隨著腫瘤的惡性程度呈依次遞增趨勢.我們推測，隨著腫瘤惡性程度的增強，CDK16在細胞質(zhì)中表達增強，這可能與腫瘤的侵襲或遷移相關(guān).

但是，本次研究還存在著諸多的不足之處，首先，樣本例數(shù)的不足.本次實驗所收集的各個類型食管癌的組織樣本均存在著例數(shù)不足的情況.當然，這也與某些類型的食管癌的病例較少有關(guān)系.第二，實驗方法的不足.本次研究主要使用的就是組織芯片結(jié)合免疫組化的技術(shù)方法，而這對實驗結(jié)論的得出稍顯不足.

接下來，將進一步深入研究本課題.一方面，擴大樣本量，重點便是食管鱗癌的組織樣本.在保證例數(shù)增加的同時也要盡量保證每個病例的各項臨床病理參數(shù)的完整，包括患者的生存期.這樣便可以通過數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析來探究CDK16的表達與食管鱗癌的各項臨床病理參數(shù)及病患生存期之間的關(guān)系.另一方面，通過細胞學實驗來研究CDK16對食管鱗癌的各項細胞學功能的影響，包括細胞生長及增殖、細胞遷移與侵襲以及細胞凋亡等，從而進一步地研究并闡明CDK16與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系.