李曉雪，王 勇，孫繼奇，朱曄榮，馬 琳，向蓓蓓*

(1 南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071；2 天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 300193)

川西獐牙菜(SwertiamussotiiFranch)是龍膽科獐牙菜屬植物，俗稱“藏茵陳”，藏名“斗大”、“桑蒂”。主要生長分布在青海、西藏、四川等海拔3 800 m以上的高寒地區(qū)。全草入藥，是藏藥中極具特色的治療熱癥、肝膽病及血液病的常用藥物。具有清熱利膽、除濕、舒肝健胃、強(qiáng)心、養(yǎng)血、解毒等作用[1]?，F(xiàn)已生產(chǎn)片劑、針劑等多種劑型的藥物應(yīng)用于臨床治療黃疸型肝炎、病毒性肝炎，血病等疾病[2]。

其主要有效成分為裂環(huán)烯醚萜類(獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龍膽苦苷等)、三萜類(齊墩果酸、烏蘇酸等)、黃酮類等化合物[3]。裂環(huán)烯醚萜化合物是一類特殊的單萜化合物，其苷元結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為母核中環(huán)戊烷的C7-C8處斷鍵成裂環(huán)狀態(tài)。在植物界中此類化合物是由焦磷酸香葉酯(GPP)經(jīng)生物合成途徑生成臭蟻二醛再縮醛衍生而成，廣泛分布于木犀科、茜草科、龍膽科、唇形科等雙子葉植物中[4-5]。裂環(huán)烯醚萜在生物合成中常是吲哚生物堿的前體物質(zhì)，研究表明，一些裂環(huán)烯醚萜類化合物對(duì)中樞神經(jīng)、心血管和消化系統(tǒng)都有一定的生物活性[6]。川西獐牙菜中7-脫氧馬錢子酸羥化酶(7-deoxyloganic acid-7-hydroxylase, SmDL7H)是其裂環(huán)烯醚萜類化合物合成途徑的關(guān)鍵酶，該酶屬于細(xì)胞色素p450氧化酶家族中的一員，是一種依賴于NADPH與氧分子的酶，能夠催化7-脫氧馬錢子酸的C-7位發(fā)生羥基化生成馬錢子酸，馬錢子酸再經(jīng)過一系列的催化反應(yīng)生成具有藥理活性的龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷等裂環(huán)烯醚萜類化合物[7-9]。7-脫氧馬錢子酸羥化酶目前僅在長春花[7]、金銀花[8]等少數(shù)植物中有對(duì)其功能進(jìn)行研究的報(bào)道。

本研究依據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期工作獲得川西獐牙菜轉(zhuǎn)錄組，從中首次獲得了川西獐牙菜7-脫氧馬錢子酸羥化酶基因(SmDL7H)的全長cDNA序列。設(shè)計(jì)特異性引物，通過同源克隆得到了該基因。利用生物信息學(xué)方法，對(duì)其與其他植物中的DL7H基因進(jìn)行分析比對(duì)，并構(gòu)建進(jìn)化樹，分析同源關(guān)系，同時(shí)對(duì)其結(jié)構(gòu)域以及信號(hào)肽等信息作出了預(yù)測(cè)分析。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-SmDL7H，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)，得到與預(yù)期蛋白大小一致的目的蛋白。利用熒光定量PCR對(duì)川西獐牙菜不同組織中SmDL7H基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SmDL7H基因在川西獐牙菜葉、莖、花、根、愈傷組織中均有表達(dá)，其中在葉片中表達(dá)量最高，在根中表達(dá)量最低。本研究為研究川西獐牙菜中的7-脫氧馬錢子羥化酶的功能，以及為探索川西獐牙菜中裂環(huán)烯醚萜類化合物合成途徑奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他近緣植物研究該類化合物生物合成途徑提供了研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)材料為在實(shí)驗(yàn)室中光照16 h、黑暗8 h、22 ℃培養(yǎng)種植的生長8個(gè)月已抽薹開花的川西獐牙菜(SwertiamussotiiFranch)植株。

1.2 方 法

1.2.1葉片總RNA提取及cDNA合成按照Eastep Super總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行川西獐牙菜葉片總RNA的提取，用1.1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000對(duì)RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)試劑盒說明書對(duì)葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SmDL7H基因的克隆根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期工作，從川西獐牙菜轉(zhuǎn)錄組中獲得了SmDL7H基因的全長cDNA序列，并結(jié)合pET-28a原核表達(dá)載體的酶切位點(diǎn)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物7B UP(5′CCGGAATTCATGGGAATAAGCTTAGAGACC 3′)和 7B DP (5′ACGCGTCGAC-GAGTTTGTGCAATATCAAGTGA 3′，劃線部分為酶切位點(diǎn)序列)。以川西獐牙菜葉片cDNA第一鏈為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，58 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸90 s，31個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。獲得的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，按照快速瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒的說明書進(jìn)行切膠回收?；厥漳康钠闻cpEASY-Blunt Simple Cloning Vector按照說明書進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化EscherichiacoliTrans 5α，挑取陽性克隆送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3SmDL7H基因序列的生物信息學(xué)分析利用NCBI網(wǎng)站，分析比對(duì)川西獐牙菜SmDL7H基因與其他植物中的DL7H基因的同源性及結(jié)構(gòu)域；使用DNAMAN軟件對(duì)川西獐牙菜SmDL7H與其他植物中的DL7H的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；用ExPASy Proteomics Server(http://www.expasy. ch/tools/protparam.html)網(wǎng)站對(duì)川西獐牙菜的SmDL7H基因編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)的分析。使用SignalP4.0 Server(http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線網(wǎng)站進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)分析。用MEGA 7.0軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap 1 050次。

1.2.4SmDL7H基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建將測(cè)序正確的pEASY-Blunt Simple-SmDL7H與pET-28a原核表達(dá)載體，用EcoR I和SalI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。將酶切產(chǎn)物經(jīng)過切膠回收和連接后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入EscherichiacoliRosetta(DE3)中，選取陽性轉(zhuǎn)化子，送去華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5SmDL7H基因的原核表達(dá)挑取測(cè)序正確含有pET-28a-SmDL7H重組質(zhì)粒的Rosetta(DE3)的單菌落，接種于LB(含有50 μg/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min進(jìn)行小量培養(yǎng)12 h。至菌OD為0.6～0.8時(shí)接種1 mL于400 mL LB(含有50 μg/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，25 ℃、8 h擴(kuò)大培養(yǎng)，至菌OD為0.6～0.8時(shí)加入0.1 mol/L IPTG，25 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)12 h。將誘導(dǎo)好的菌液進(jìn)行5000 r/min、4 ℃、10 min離心，收集菌體棄去上清液。按照1∶10比例用Binding buffer(0.5 mmol/L NaCl；20 mmol/L 咪唑；20 mmol/L 磷酸鈉)將菌體重懸后，進(jìn)行超聲破碎10 min。破碎后的液體，進(jìn)行5 000 r/min、4 ℃、10 min離心，收集上清液棄去沉淀。取8 μL上清液與8 μL的2×上樣緩沖液均勻混合后，取8 μL用SDS-PAGE(4.5%濃縮膠和12.5%的分離膠)進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.6川西獐牙菜葉片誘導(dǎo)愈傷組織剪取生長8個(gè)月已抽薹開花的川西獐牙菜的葉片，用10%次氯酸鈉消毒7 min，用滅菌蒸餾水清洗5次后，放置于添加了3 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L 6-BA的MS固體培養(yǎng)基上。放置于培養(yǎng)架光照16 h、黑暗8 h、22 ℃進(jìn)行培養(yǎng)30 d。選取生長良好的愈傷組織放置于繼代培養(yǎng)基(MS固體培養(yǎng)基+2 mg/L 6-BA)，于培養(yǎng)架光照16 h、黑暗8 h、22 ℃進(jìn)行培養(yǎng)15 d，獲得長勢(shì)良好的愈傷組織。

1.2.7SmDL7H基因表達(dá)分析取生長8個(gè)月已抽薹開花的川西獐牙菜的葉、莖、花、根，以及用葉片誘導(dǎo)生長45 d的川西獐牙菜愈傷組織。提取RNA與反轉(zhuǎn)cDNA第一條鏈的方法同上。將cDNA稀釋5倍用作qRT-PCR的模板，選用actin基因作為內(nèi)參。按照SYBR Premix Ex Taq II的說明書設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)的引物為SmDL7HqRT-PCR up (5′ GTAAGTAAATGGGAGGAGAAGGT3′)和SmDL7HqRT-PCR dp (5′ CAGGGATGTGAACAGAACGAC-3′)；actinup (5′ ACTGGTGTTATGGTTGGTATGG-3′)和actindp (5′ TCGGTGAGAAGTATAGGGTGC-3′)。qRT-PCR的25 μL反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL；滅菌蒸餾水9.5 μL；上游引物0.5 μL；下游引物0.5 μL；cDNA 2 μL。qRT-PCR反應(yīng)在iCycler Thermal Cycler的儀器上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。用actin作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT方法來進(jìn)行基因表達(dá)量的確定，其中參照物的表達(dá)量設(shè)置為“1”。

2 結(jié)果與分析

2.1 川西獐牙菜SmDL7H基因的克隆

以川西獐牙菜葉片的cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1 554 bp處有特異性片段(圖1)。將該特異性片段連接在pEASY-Blunt Simple Cloning Vector送去華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)過序列比對(duì)及生物信息學(xué)方法分析，獲得的片段與我們預(yù)測(cè)分析的序列一致(圖2)，即為川西獐牙菜SmDL7H基因，GenBank登錄號(hào)為MH243070。

2.2 川西獐牙菜SmDL7H基因的理化性質(zhì)分析

SmDL7H基因編碼蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)與分析顯示，SmDL7H基因共編碼的517個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為9.02，蛋白分子量為59.5 kD，59個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基，68個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基，分子式為C2708H4257N715O747S23。穩(wěn)定性指數(shù)為37.5，脂溶系數(shù)為91.82，親水性平均數(shù)為-0.169，說明該蛋白為一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水溶性蛋白。

M. DL2000； 1.陰性對(duì)照； 2. SmDL7H 圖1 SmDL7H基因的PCR擴(kuò)增M. DL2000; 1. Negative control; 2. SmDL7HFig.1 PCR amplification of SmDL7H gene

圖2 川西獐牙菜SmDL7H基因核苷酸序列與推測(cè)的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and putative amino acid sequences of SmDL7H gene from Swertia mussotii Franch

圖3 SmDL7H蛋白的保守功能域Fig.3 The conserved domains of SmDL7H protein

2.3 川西獐牙菜SmDL7H蛋白的保守功能域與信號(hào)肽的推測(cè)分析

川西獐牙菜SmDL7H基因編碼氨基酸序列，與其他植物中DL7H基因編碼的氨基酸序列， Blast對(duì)比結(jié)果(圖3)表明，川西獐牙菜SmDL7H編碼的蛋白屬于p450超家族。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果(圖4)表明，川西獐牙菜SmDL7H編碼的蛋白不含信號(hào)肽。

2.4 川西獐牙菜SmDL7H的聚類分析

為了了解川西獐牙菜SmDL7H基因的功能，利用MEGA 7.0軟件對(duì)川西獐牙菜SmDL7H基因編碼的氨基酸序列與NCBI上已公開的滇龍膽(AKI87771.1)、印度蛇根草(AGX93059.1)和小蔓長春花(AGX93061.1)等的DL7H基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果(圖5)顯示，川西獐牙菜編碼的SmDL7H蛋白與滇龍膽編碼的DL7H蛋白共聚一支，證明二者具有更近的親緣關(guān)系。同時(shí)利用DNAMAN軟件將滇龍膽、印度蛇根草和小蔓長春花等的DL7H氨基酸序列，與川西獐牙菜中的SmDL7H的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果(圖6)顯示，川西獐牙菜中的SmDL7H蛋白與多個(gè)物種的DL7H蛋白具有較高的相似性。

2.5 川西獐牙菜SmDL7H基因原核表達(dá)

將pET-28a原核表達(dá)載體與pEASY-Blunt Simple-SmDL7H質(zhì)粒用EcoR I和SalI進(jìn)行雙酶切，得到SmDL7H基因全長序列與酶切后的pET-28a原核表達(dá)載體。將SmDL7H基因全長序列與酶切后pET-28a原核表達(dá)載體用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(DE3)中。將pET-28a原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入Rosetta(DE3)中作為陰性對(duì)照，簡稱為Rosetta-pET-28a。將Rosetta-pET-SmDL7H與陰性對(duì)照用相同的條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)后的Rosetta-pET-28a和Rosetta-pET-SmDL7H用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。在59.5 kD處有目的蛋白的出現(xiàn)(圖7)，與之前預(yù)測(cè)的蛋白大小是相一致的。

圖4 川西獐牙菜SmDL7H基因編碼的蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析Fig.4 Prediction of signal peptide of SmDL7H protein encoding by SmDL7H gene

圖5 川西獐牙菜SmDL7H蛋白進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogentic tree analysis of DL7H proteins

AKI87771.1. 滇龍膽；AGX93059.1.印度蛇根草；AGX93061.1.小蔓長春花； AGX93057.1.金雞納樹；AGX93060.1.水甘草；AGX93062.1.長春花；AGX93058.1.蟾蜍樹；AGX93056.1.金銀花圖6 川西獐牙菜SmDL7H與其他植物DL7H同源蛋白的多序列比對(duì)AKI87771.1 Gentiana rigescens; AGX93059.1.Rauvolfia serpentine; AGX93061.1.Vinca minor; AGX93057.1.Cinchona calisaya; AGX93060.1. Tabernaemontana elegans; AGX93062.1.Catharanthus roseus; AGX93058.1.Amsonia hubrichtii; AGX93056.1. Lonicera japonicaFig.6 Multiple sequence alignment of SmDL7H protein and DL7H homologous proteins from other plants

M. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. 轉(zhuǎn)入pET-28a載體的Rosetta(DE3)菌株；2. 轉(zhuǎn)入pET-28a-SmDL7H載體的Rosetta(DE3)菌株圖7 重組蛋白的表達(dá)M. Protein marker(low); 1. Expression product of Rosetta-pET-28a;2. Expression product of Rosetta-pET-SmDL7HFig.7 Expression recombinant protein

圖8 川西獐牙菜SmDL7H基因在不同組織中的表達(dá)Fig.8 Different tissue expression profiles of SmDL7H gene in S. mussotii Franch

2.6 川西獐牙菜SmDL7H基因的組織表達(dá)特異性分析

熒光定量PCR結(jié)果(圖8)顯示，川西獐牙菜SmDL7H基因在川西獐牙菜的葉片、莖、花、根、愈傷組織中均有表達(dá)，其中在葉片中表達(dá)量最高，在根中表達(dá)量最少。推測(cè)，是由于裂環(huán)烯醚萜化合物合成途徑在質(zhì)體中進(jìn)行，而葉片中葉綠體含量較多，故而該基因在葉片中表達(dá)量最高。

3 討 論

“藏茵陳”是一類治療肝膽疾病的藥物的總稱，川西獐牙菜是其基原植物之一，川西獐牙菜作為“藏茵陳”入藥在許多典籍，例如《晶珠本草》、《四部醫(yī)典》等藏醫(yī)藥典籍中均有記載。使用歷史悠久、療效甚佳。其有效成分主要為裂環(huán)烯醚萜類與三萜類等化合物[9-10]。川西獐牙菜生長于高寒地區(qū)，種子萌發(fā)率較低，并且無人工大規(guī)模種植。隨著民族醫(yī)藥的興起，對(duì)其的需求量日益增長，導(dǎo)致其野生資源受到嚴(yán)重的損害[11]。目前，對(duì)于川西獐牙菜在分子生物學(xué)方面的研究較少，對(duì)于其裂環(huán)烯醚萜生物合成途徑的研究亦較少。本課題組在前期工作中完成了川西獐牙菜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)川西獐牙菜裂環(huán)烯醚萜途徑關(guān)鍵酶牻牛兒基焦磷酸合成酶(geranyl diphosphate synthase; GPPS)及環(huán)烯醚萜合成酶(iridoid synthase; IS)的功能進(jìn)行了探索[12-13]。川西獐牙菜SmDL7H能夠催化7-脫氧馬錢子酸生成馬錢子酸，是川西獐牙菜裂環(huán)烯醚萜生物合成途徑中較下游位置的關(guān)鍵酶。對(duì)于DL7H在植物中的研究較少，目前僅有長春花[7]和金銀花[8]中DL7H的功能研究報(bào)道。對(duì)川西獐牙菜中的7-脫氧馬錢子酸羥化酶的深入研究，來提高川西獐牙菜中裂環(huán)烯醚萜類化合物的合成具有較大意義。

本研究首次在川西獐牙菜中克隆得到的7-脫氧馬錢子酸羥化酶基因(SmDL7H)的全長cDNA序列，并且通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析，與已在NCBI上公布的植物中的DL7H的氨基酸序列進(jìn)行分析比對(duì)，預(yù)測(cè)得知該基因亦屬于p450超家族，并且無信號(hào)肽，且與滇龍膽、長春花[7]、金銀花[8]等植物的DL7H具有較高相似性，故而推測(cè)SmDL7H與它們亦有相似的功能，能夠催化7-脫氧馬錢子酸生成馬錢子酸。同時(shí)，對(duì)SmDL7H基因進(jìn)行了原核表達(dá)工作，為后續(xù)的蛋白純化工作、體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)、蛋白結(jié)晶解析蛋白構(gòu)象等工作提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

本研究分析了川西獐牙菜不同器官中SmDL7H基因的RNA表達(dá)水平，該基因在葉、莖、花、根中均有表達(dá)，其中在葉片中表達(dá)量最高，在根中表達(dá)量最少，這與劉越等[14]研究結(jié)果一致。在趙忠娟等[15]的研究中，發(fā)現(xiàn)川西獐牙菜愈傷組織中有效成分種類與原植株中的一致，并且愈傷組織的生長速率遠(yuǎn)高于原植株。因此，川西獐牙菜的愈傷組織可能是一個(gè)較好的生物反應(yīng)器，相較于原植物的根系能夠產(chǎn)生較多的有效成分，同時(shí)緩解了川西獐牙菜野生資源的匱乏及相應(yīng)的環(huán)境壓力。在后續(xù)工作中，本課題組將繼續(xù)研究川西獐牙菜的愈傷組織該途徑中其他關(guān)鍵基因的表達(dá)譜及裂環(huán)烯醚萜類化合物積累的相關(guān)性，期望川西獐牙菜愈傷組織可作為生物反應(yīng)器提高川西獐牙菜中裂環(huán)烯醚萜類化合物的含量，從而解決川西獐牙菜資源匱乏的難題。