史 俊，席剛俊，賈 君，經守萄

(1.江蘇農林職業(yè)技術學院，江蘇句容212400;2.江蘇茅山地道中藥材種植有限公司，江蘇句容212400)

白芨(Bletilla striate)隸屬于蘭科白芨屬，為地生蘭的一種，種子極小，結構簡單且無胚乳，自然繁殖率極低［1］，是多年生落葉植物。其塊莖可供藥用，花紫紅色，株形優(yōu)美，集藥用與觀賞于一體。白芨喜溫暖、陰濕的環(huán)境，廣泛分布于貴州、四川、湖南、湖北、安徽、江蘇、河南、云南、廣西、浙江等省(區(qū))［2］，江蘇省鎮(zhèn)江市茅山地區(qū)生產的白芨品質較佳，是茅山地區(qū)的道地藥材。白芨鱗莖入藥，性平、味苦，民間常將其作為膠粘性止血劑，用于補肺、生肌、祛痰、止血，治療吐血、肺病、咳血、慢性胃潰瘍等［3－4］。白芨中含量較高的白芨膠可以替代阿拉伯膠等膠劑作為混懸劑及乳化劑，可廣泛用于食品及化工領域［5－6］。盲目采挖加劇了白芨野生資源的減少，導致其瀕臨滅絕，被國家列為重點保護野生藥用植物之一，屬瀕危植物［7］，同時也被列入《瀕危野生動植物國際貿易公約》(CITES)保護種類［2］。白芨常規(guī)以分株繁殖為主，但其繁殖效率較低，很難適應規(guī)模化種植的需要。對包括白芨在內的蘭科植物而言，通過無菌播種與組織培養(yǎng)，可以在短時間內獲得大量的實生苗，不失為一種快速有效的繁殖方法［8－12］。但一般白芨組培周期較長，成本高，如果獲得的白芨實生苗沒有產生假鱗莖，移栽成活率將會大大降低，因此，改良組培工藝，降低組培成本，快速繁殖出有假鱗莖的白芨組培苗對白芨的大面積推廣有十分重要的意義。本試驗選擇白芨成熟未開裂的朔果作為材料，采用白芨種子液體培養(yǎng)+固體培養(yǎng)的方式來研究不同因素對白芨原球莖和假鱗莖誘導和生長的影響，為建立高效的白芨快繁技術體系提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用白芨于2014年5月種植于江蘇茅山地道中藥材種植有限公司中藥材種植基地，經江蘇省句容市中醫(yī)院藥劑科主任經守萄鑒定為紫花白芨，2015年11月采集其開花授粉后約120 d、尚未開裂的蒴果作為試驗材料，在江蘇農林職業(yè)技術學院生物工程技術中心組培實驗室開展試驗。

1.2 方法

1.2.1 滅菌和接種 將其蒴果用流水洗凈后，再用75%乙醇消毒30 s，然后用0.1%HgCl2溶液消毒10 min，無菌水沖洗4～6次。在超凈工作臺上，剖開蒴果，將粉末狀的種子播到培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)24 h，用移液槍吸取種子懸浮液，統(tǒng)計播種密度，并最終將播種密度調至20～30粒/mL，每處理接種3瓶，200 mL/瓶，3個重復。培養(yǎng)條件:25±2℃，1 200 lx(前3 d暗培養(yǎng))，光照12 h/d，轉速為120 r/min。

1.2.2 白芨種子原球莖的誘導 將白芨種子接入液體培養(yǎng)基，誘導原球莖生長，培養(yǎng)基采用L9(34)正交設計，對液體培養(yǎng)基配方中的4個因素，包括基本培養(yǎng)基、NAA濃度、6－BA濃度、馬鈴薯汁濃度等，進行培養(yǎng)條件篩選(表1)。

表1 白芨原球莖誘導的因素水平設計

1.2.3 不同培養(yǎng)基對白芨假鱗莖誘導的影響 將白芨原球莖接入分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)45 d后，將大小一致的白芨小苗分成單株接入不同處理培養(yǎng)基，每處理4瓶，每瓶25株，3個重復。接種后各處理置于組培室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(23±2)℃，每天光照12 h，光照度1 800～2 500 lx。所有處理培養(yǎng)基中均添加1.0 g/L活性炭、60 g/L香蕉泥、7.0 g/L瓊脂，pH 值為5.6。

1.2.3.1 基本培養(yǎng)基對白芨假鱗莖瓶內膨大的影響 分別以N6、MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基，不同處理均添加0.8 mg/L NAA、30.0 g/L 蔗糖。

1.2.3.2 蔗糖用量對白芨假鱗莖瓶內膨大的影響 以N6為基本培養(yǎng)基，設置蔗糖濃度梯度為30、40、50、70 g/L，不同處理添加0.8 mg/L NAA。

1.2.3.3 不同激素對白芨假鱗莖瓶內膨大的影響 以N6為基本培養(yǎng)基，設計L9(34)正交試驗對培養(yǎng)基中的6－BA、KT、NAA、IBA 4種激素用量進行篩選(表2)。

表2 激素對白芨假鱗莖誘導的因素水平設計

1.3 指標測定

分別在接種后15、30 d統(tǒng)計種子原球莖誘導率、用motic體視顯微鏡觀察原球莖的形態(tài)并量取原球莖長度和粗度。分別在接種后45、90 d統(tǒng)計假鱗莖誘導率，用游標卡尺量取假鱗莖直徑，統(tǒng)計結果采用SPSS19.0和正交分析助手Ⅱ分析。

假鱗莖誘導率=假鱗莖總數/接種數×100%;假鱗徑直徑(mm)=(假鱗莖長徑+短徑)/2;假鱗徑平均直徑(mm)=假鱗徑粒徑總和/假鱗莖總數。

2 結果與分析

2.1 不同液體培養(yǎng)基組合對白芨種子萌發(fā)及生長的影響

種子液體振蕩培養(yǎng)15 d后，用移液槍從每個重復中吸取懸浮液3 mL，統(tǒng)計原球莖誘導率，用motic體視顯微鏡觀察原球莖的形態(tài)，并量取原球莖長度和粗度，剩余的原球莖繼續(xù)培養(yǎng)15 d后，再次觀察原球莖的形態(tài)(圖1)，并量取原球莖長度和粗度(表3)。由于白芨到目前為止無真正意義上的品種，所有種植的白芨都來源于野生資源，多為雜合基因型，其后代種子有豐富的遺傳多樣性，在培養(yǎng)的過程中呈現(xiàn)出豐富的多樣性，同處理內原球莖生長差異較大，并且隨著養(yǎng)培時間的延長，這種差異不斷增大，為了避免種子遺傳差異性對分析的影響，不同因素對白芨原球莖生長的影響均采用培養(yǎng)15～30 d的增長量進行分析。

表3 不同因素對白芨原球莖誘導的影響

研究發(fā)現(xiàn)，不同因素對白芨原球莖的誘導和膨大效果不一致(表4)。6－BA對原球莖誘導影響較大，在原球莖誘導階段，誘導率與6－BA濃度呈正相關，但原球莖的生長受6－BA的影響相對較小，合適的NAA濃度更有利于原球莖增長，合適的6－BA濃度更有利于原球莖的增粗，天然附加物馬鈴薯汁對原球莖生長影響最大，R值最大。結果表明，在白芨原球莖誘導的過程中，激素起了較大的作用，而在原球莖生長的過程中，營養(yǎng)因素的作用得到了很大的提高，特別是天然附加物馬鈴薯汁。說明白芨成熟種子萌發(fā)形成原球莖所需要的營養(yǎng)物質大多來源于本身，而原球莖生長則需要從外界吸收養(yǎng)分，馬鈴薯汁所富含的有機營養(yǎng)更容易被白芨原球莖吸收和利用，這在一定程度上解釋了白芨種子自然萌發(fā)需要同真菌共生，由真菌為其萌發(fā)提供有機次生代謝產物。綜合分析，白芨種子萌發(fā)形成原球莖的最適培養(yǎng)基為 N6+0.5 mg/L NAA+60 g/L馬鈴薯汁。

2.2 不同基本培養(yǎng)基對假鱗莖誘導的影響

研究發(fā)現(xiàn)，基本培養(yǎng)基的選擇因不同的植物材料和培養(yǎng)目標而有一定差異(表5)。在一定范圍內，較高的氮素含量較有利于白芨假鱗莖的誘導和膨大，其中以N6培養(yǎng)基的假鱗莖誘導率和粒徑最大。從基本培養(yǎng)基成分上來看，N6培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基總氮濃度基本相當，但N6培養(yǎng)基中的氨態(tài)氮含量更高，說明白芨對氨態(tài)氮更加偏好，而低無機鹽濃度的1/2MS更加利于生根，白芨根多且壯，長有白色根毛，隨著根的發(fā)育，白芨組培苗對培養(yǎng)基養(yǎng)分的吸收能不斷加強。因此，在后期培養(yǎng)中，1/2MS培養(yǎng)基的假鱗莖直徑增加量最大。

2.3 不同蔗糖濃度對假鱗莖誘導的影響

研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度過高和過低，均不利于白芨假鱗莖的誘導和膨大(表6)。當蔗糖濃度為30 g時，白芨假鱗莖的誘導率最高，隨著蔗糖濃度的提高，誘導率呈現(xiàn)下降趨勢。在蔗糖濃度不高于50 g/L時，誘導率差異不顯著，白芨假鱗莖直徑隨蔗糖濃度的提高呈正態(tài)分布;當蔗糖濃度為50 g/L時，白芨假鱗莖直徑達到最大，并在隨后的培養(yǎng)中，假鱗莖膨大的速度也最快，在培養(yǎng)90 d后與蔗糖濃度30、70 g/L時差異顯著，說明較高濃度的蔗糖有利于白芨假鱗莖的膨大，但在一定程度上抑制假鱗莖的形成。綜合考慮，50 g/L蔗糖濃度較為適合白芨假鱗莖的形成。

表4 不同因素對白芨原球莖誘導影響的極差分析

2.4 不同激素配比對假鱗莖誘導的影響

研究發(fā)現(xiàn)，白芨假鱗莖誘導和膨大跟激素間的配比有著緊密的關系，假鱗莖的誘導、膨大，包括在膨大過程中的不同階段，所需要的激素配比是不一樣的(表7、表8)。當 IBA為1.0 mg/L時，誘導率最高，但不添加IBA的處理在假鱗莖膨大初期卻表現(xiàn)最佳，隨著培養(yǎng)的繼續(xù)進行，添加1.0 mg/L IBA的處理白芨假鱗莖膨大速度加快，并最終達到最優(yōu)。極差分析結果表明，NAA對白芨假鱗莖誘導和膨大影響最大，R值最大;其次為KT，KT主要對假鱗莖膨大產生影響，IBA和6－BA影響較小。綜合上述分析，最適合白芨假鱗莖誘導和膨大的激素配比為0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+2.0 mg/L 6 － BA+0.5 mg/L KT。

表5 不同培養(yǎng)基對假鱗莖誘導的影響

表6 不同蔗糖濃度對假鱗莖誘導的影響

表7 不同激素對白芨假鱗莖誘導的影響

3 討論

3.1 不同的培養(yǎng)基對種子萌發(fā)的影響

成熟的白芨種子萌發(fā)形成原球莖對培養(yǎng)條件要求不高，只要培養(yǎng)的時間足夠長，都能得到較高的萌發(fā)誘導率，這與張建霞等研究的結果［1］一致。但不同的基本培養(yǎng)基對種子萌發(fā)形成原球莖還是會有一定的影響，MS和N6培養(yǎng)基都是植物組織培養(yǎng)中常用的基本培養(yǎng)基，MS營養(yǎng)成分豐富，各元素比例適中，在植物的胚、原球莖、莖段等組培中得到了廣泛應用［13－17］。N6培養(yǎng)基成分較簡單，但 KNO3含量較高，常常應用于禾本科植物、花藥培養(yǎng)、鐵皮石斛組培中，本研究對MS、1/2MS、N6培養(yǎng)基對白芨種子萌發(fā)形成原球莖的影響進行了研究，發(fā)現(xiàn)大量元素、無機鹽水平較高的MS對種子萌發(fā)形成原球莖較為有利，而無機鹽含量最低的1/2MS較不利于白芨原球莖的形成，說明白芨種子萌發(fā)形成原球莖需要較高的無機鹽水平。同樣，李瑩等研究發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基對同為蘭科植物的鐵皮石斛種子萌發(fā)也十分有利［18］。與種子萌發(fā)不同的是N6培養(yǎng)基最有利于原球莖的膨大，相對于MS基本培養(yǎng)基，N6培養(yǎng)基含有較高水平的硝態(tài)氮，而氨態(tài)氮含量相對較低，這說明白芨可能對氨態(tài)氮更加偏好。植物生長調節(jié)物質在組織培養(yǎng)中用量極小，但卻是不可缺少的關鍵物質，是植物組織培養(yǎng)中發(fā)揮生物學效力最強的培養(yǎng)因素。鐘士傳等發(fā)現(xiàn)，植物生理活動是由各種外源激素和內源激素水平比例調控的，對種子萌發(fā)原球莖誘導和膨大也有重要的影響［19］?？傮w來看，較高濃度的NAA、6－BA更有利于種子萌發(fā)形成原球莖。而NAA在中濃度時(0.5 mg/L)最有利于原球莖的整體膨大，過高過低都對原球莖膨大產生負面影響，6－BA在低濃度(0 mg/L)和高濃度(2 mg/L)時促進原球莖膨大，在中濃度(1 mg/L)時抑制原球莖生長，這可能是因為6－BA在低濃度(0 mg/L)時，原球莖膨大受內源激素主導，在高濃度(2 mg/L)時原球莖膨大受外源激素主導，而在中濃度(1 mg/L)時，內外源激素相互抑制，但具體原因，還需要進行試驗分析。天然附加物馬鈴薯汁對白芨種子原球莖的誘導和膨大都有較好的促進作用，本研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯汁在中等濃度(60 g/L)最有利于種子原球莖的誘導和膨大，高濃度(120 g/L)可能會大幅度提高培養(yǎng)基滲透壓而對種子原球莖的誘導和萌大帶來不利影響?？傮w來說，白芨原球莖膨大的最適培養(yǎng)基為 N6+0.5 mg/L NAA+60 g/L馬鈴薯汁 +30 g/L 蔗糖，pH值為5.6。

表8 激素對白芨假鱗莖誘導影響的極差分析

3.2 不同的培養(yǎng)基對白芨假鱗莖誘導和膨大的影響

白芨假鱗莖是儲藏養(yǎng)分、水分的重要場所，也是主要的入藥部位，在組培中誘導假鱗莖產生和膨大，可以大幅度提高白芨組培苗的移栽成活率，縮短栽培周期，本研究從基本培養(yǎng)基、蔗糖濃度和激素的配比3個方面研究白芨假鱗莖誘導和膨大的效果，研究結果表明，在白芨假鱗莖誘導上，N6培養(yǎng)基誘導率最高;在假鱗莖膨大前期階段，N6掊養(yǎng)基效果最好;但隨著培養(yǎng)時間的延長，假鱗莖的膨大速度卻呈現(xiàn)出1/2MS＞MS＞N6，這可能是因為 MS培養(yǎng)基營養(yǎng)更加全面和豐富。1/2MS培養(yǎng)基中產生較多的根，提高了對養(yǎng)分的吸收能力。植物在組培過程中幾乎都處于異養(yǎng)狀態(tài)，需要培養(yǎng)基為其提供碳源，蔗糖不僅是重要的碳源，還能為植物提供必要的滲透壓，有研究顯示，蔗糖對部分植物塊莖、球莖、鱗莖、圓球莖的形成有影響［19－22］。在本研究中，白芨假鱗莖的誘導隨蔗糖濃度的提高而降低，而粒徑在一定范圍內(≤50 g/L)隨蔗糖濃度的提高而提高，但植株長勢卻逐漸變差，褐化加劇，說明高濃度的蔗糖不但抑制白芨假鱗莖的形成，同時還能促進了多酚氧化酶的活性，加劇了褐變。在保證植株正常生長的情況下，50.0 g/L蔗糖濃度對假鱗莖的誘導效果相對較好。本研究結果發(fā)現(xiàn)，不同的激素組合和水平對白芨假鱗莖誘導有明顯差異;在NAA、IBA、6－BA和 KT 4個因素中，NAA和 KT影響較大，IBA和6－BA影響相對較小。因此，白芨假鱗莖誘導的最適培養(yǎng)基為N6+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+2.0 mg/L 6－BA+0.5 mg/L KT+50 g/L蔗糖 +60 g/L香蕉泥+7 g/L瓊脂，pH值為5.6。