周 瑩，白 鈺，嚴 輝，蔣 益，唐曉清，丁安偉

(1.南京農(nóng)業(yè)大學中藥材研究所，江蘇南京210095;2.南京中醫(yī)藥大學/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023;3.亞邦醫(yī)藥股份有限公司，江蘇常州213163)

荊芥(Schizonepeta tenuifolia Briq)為唇形科植物，以全草入藥，稱為“荊芥”，以花穗入藥，稱為“荊芥穗”，其性辛，微溫，歸肺、肝經(jīng)，具有解表散風、透疹、消瘡的功效，主治感冒、頭痛、麻疹、風疹、瘡瘍初起等癥［1］。目前已從荊芥中分離鑒定出揮發(fā)油、單萜苷、黃酮、有機酸、三萜、甾體類等化學成分［2］。現(xiàn)代藥理試驗結(jié)果表明，荊芥具有抗炎、抗病毒、抑菌、解熱鎮(zhèn)痛等作用［2－3］。除了入藥，荊芥還可作為蔬菜食用［4］。荊芥分布地域較廣，野生和栽培類型均有，但不同產(chǎn)地荊芥藥材質(zhì)量參差不齊，現(xiàn)主產(chǎn)于河北、河南等地。江蘇地區(qū)荊芥的栽培已有200多年歷史，尤以武進孟河附近所產(chǎn)者質(zhì)優(yōu)，稱為“孟荊芥”。優(yōu)良的種子種苗是藥用植物栽培生產(chǎn)的第1個環(huán)節(jié)，種子種苗的質(zhì)量是提高中藥產(chǎn)品產(chǎn)量、品質(zhì)的基礎(chǔ)，是促進中藥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要保證。目前對荊芥的研究主要集中于化學成分、藥理藥效、揮發(fā)油提取工藝等，鮮有對其種質(zhì)資源以及萌發(fā)特性的報道。本研究主要著重于不同產(chǎn)地荊芥種子凈度、千粒質(zhì)量、含水量等外在品質(zhì)指標間的差異，不同溫度和溶液pH值以及覆土厚度對荊芥種子萌發(fā)特性的影響，以期為荊芥種質(zhì)資源評價提供參考依據(jù)，為荊芥標準化栽培技術(shù)體系的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試樣品 荊芥種子于2015年10月收集于江蘇、河南、河北、安徽4個地區(qū)，具體來源和編號見表1。所收集的種子均由南京農(nóng)業(yè)大學中藥研究所王康才教授鑒定屬于唇形科植物荊芥(Schizonepeta tenuifolia Briq)。

表1 荊芥種子來源及編號

1.1.2 儀器及藥品 1/10 000電子天平AR1140，樣品盒，玻璃培養(yǎng)皿，電熱恒溫鼓風干燥箱DHG－9140A，光照培養(yǎng)箱GXZ－800B;磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀試劑，均為分析純。覆土試驗所用基質(zhì)為蓓蕾牌有機栽培基質(zhì)(氮、磷、鉀含量≥2%，有機物含量≥35%，水分含量≤45%，pH值為5.5～6.5)。

1.2 方法

1.2.1 取樣方法 從待檢驗的荊芥種子袋中分上、中、下3層用扦樣器分別取樣，將取得的樣品混合，作為混合樣品。將混合樣品置于平滑玻璃板上，用分樣板將樣品先縱向混合，再橫向混合，重復混合4～5次，然后將種子攤平成正方形，用分樣板劃2條對角線，使樣品分成4個三角形，再取2個對頂三角形內(nèi)的樣品繼續(xù)按上述方法分取，直到2個三角形內(nèi)的樣品接近2份試驗樣品的質(zhì)量為止(50～200 g)。經(jīng)過分樣取得的2份平均樣品，1份供檢驗凈度(包括千粒質(zhì)量、純度、發(fā)芽率等)，1份供檢驗水分，立即置于密閉容器內(nèi)。

1.2.2 種子凈度的測定 采用四分法。取各樣品種子進行稱質(zhì)量，記為m1，將其倒在光潔的玻璃板面上，將純凈種子和雜質(zhì)分開，并稱質(zhì)量，純凈種子質(zhì)量記為m2，雜質(zhì)質(zhì)量記為m3。重復3次。在種子篩選和稱質(zhì)量的時候，可能由于操作而造成m2+m3＜m1，因此，需對該數(shù)據(jù)進行驗證。增失差=［(m1－m2－m3)/m1］×100%，當增失差 ＞5%，則該數(shù)值不可取，需重做。根據(jù)下列公式計算種子的凈度:種子凈度=［m2/(m2+m3)］×100%。

1.2.3 種子千粒質(zhì)量的測定 將全部純凈的種子用四分法分成4份，從每份中隨機取250粒，共1 000粒為1組，每組重復3次，取其平均值為千粒質(zhì)量。

1.2.4 種子含水量的測定 采用105℃恒質(zhì)量法(標準法)。取0.5 g整粒種子直接用于含水量的測定。先將稱量盒于105℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量，再將樣品置于預先烘干和稱質(zhì)量的樣品盒內(nèi)，稱取試樣3份。然后打開盒蓋，一起置于(105±2)℃的烘箱內(nèi)，經(jīng)10 h后取出，蓋上蓋子置于干燥器內(nèi)冷卻后稱質(zhì)量;再放入(105±2)℃烘箱內(nèi)2 h后取出，蓋上蓋子置于干燥容器內(nèi)冷卻后稱質(zhì)量，直至后次稱質(zhì)量和前次稱質(zhì)量之差不超過0.02 g為止，記下最后一次結(jié)果作為烘干后質(zhì)量。種子水分含量=［(烘前試樣質(zhì)量－烘后試樣質(zhì)量)/烘前試樣質(zhì)量］×100%。

1.2.5 溫度與pH值發(fā)芽試驗 以發(fā)芽溫度與pH值作為試驗因素，采用2因子完全隨機區(qū)組設(shè)計。溶液pH值設(shè)置3個水平:6、7、8，磷酸鹽緩沖溶液濃度為 0.05 mol/L，萌發(fā)溫度設(shè)置10、20、30℃ 3個水平。種子萌發(fā)采用培養(yǎng)皿紙上床法，即在玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)鋪2層定性濾紙，作為發(fā)芽床。每個發(fā)芽床隨機放置100粒種子，每個處理設(shè)3次重復。將種子置于光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，光照時間為16 h(6:00—22:00)，光照率為33%。試驗于2015年12月20日至2016年1月3日進行，每天定期補充緩沖液，保持濕潤，以胚軸突破種皮作為種子發(fā)芽的標準。對每天萌發(fā)的種子進行記錄(2 d后進行統(tǒng)計)，以3 d內(nèi)沒有新芽萌發(fā)為結(jié)束標準。

1.2.6 覆土試驗 以有機質(zhì)為栽培基質(zhì)，播種于育苗盤中。設(shè)定不覆土和覆土 0.5、1.0、1.5、2.0 cm 4 種覆土厚度，選取顆粒飽滿的種子播種，每個處理播20粒種子，設(shè)3次重復。試驗于2016年1月5日至1月20日在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行，每天定時澆水，保持基質(zhì)濕潤。每天統(tǒng)計出苗率(7 d后進行統(tǒng)計)，以3 d內(nèi)出苗率保持不變作為結(jié)束的標準。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2013和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理和計算，用Duncan's法進行多重比較。采用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法對6個產(chǎn)地荊芥種子的品質(zhì)進行綜合評價，利用公式X(μ)=(X－Xmin)/(Xmax－Xmin)計算凈度、千粒質(zhì)量2個檢驗指標的隸屬函數(shù)值;用X(μ)=1－(X－Xmin)/(Xmax－Xmin)計算含水量檢驗指標的隸屬函數(shù)值。式中:X為某一檢驗指標的測定值;Xmax為某指標的測定最大值;Xmin為某指標的測定最小值。先求出每個產(chǎn)地各指標隸屬值，再把每一指標的隸屬值累加求平均值，平均值越大，外在品質(zhì)越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地荊芥種子外在品質(zhì)檢驗

由表2可知，HB－AG荊芥種子凈度最高，其次是HN－ZK、JS－TC荊芥種子，三者的凈度顯著高于其余3個產(chǎn)地(p＜0.05);栽培類型的HN－XY、AH－BZ荊芥種子因含有大量癟種，其凈度較低;因含有較多的癟種和泥土，野生型的JS－WJ種子凈度最低。

表2 不同產(chǎn)地荊芥種子外在品質(zhì)檢驗結(jié)果(n=3)

6個產(chǎn)地的荊芥種子千粒質(zhì)量為0.18～0.34 g，其中AH－BZ荊芥種子千粒質(zhì)量最高，觀察發(fā)現(xiàn)，相比于其他產(chǎn)地的荊芥種子，野生類型的JS－TC荊芥種子偏小，千粒質(zhì)量顯著低于其余5個產(chǎn)地(p＜0.05)。

6個產(chǎn)地的荊芥種子含水量為7.29% ～10.25%，其中HN－XY荊芥種子的含水量顯著高于其余5個產(chǎn)地(p＜0.05)，HN－ZK荊芥種子含水量顯著低于其余5個產(chǎn)地(p＜0.05)。除野生類型的JS－WJ、JS－TC產(chǎn)地的荊芥種子含水量之間沒有顯著差異外，其余4個產(chǎn)地之間差異顯著(P ＜0.05)。

由表3可知，栽培類型的荊芥種子外在品質(zhì)優(yōu)于野生類型，優(yōu)劣排序依次是 HB－AG、HN－ZK、AH－BZ、HN－XY、JS－WJ、JS－TC。

表3 不同產(chǎn)地荊芥種子外在品質(zhì)綜合評價結(jié)果

2.2 溫度和溶液pH值對荊芥種子萌發(fā)特性的影響

由圖1可知，6個產(chǎn)地荊芥種子發(fā)芽的適宜pH值均為6，pH值為7或8時，荊芥種子發(fā)芽率極低或者不萌發(fā)。pH值為6時，隨著溫度的升高，JS－WJ荊芥種子發(fā)芽率逐漸降低，并在10℃時先于20℃完成發(fā)芽。10℃時，JS－TC荊芥種子發(fā)芽率明顯低于20、30℃條件下的發(fā)芽率，雖然在30℃條件下，JS－TC種子能夠在較短時間內(nèi)完成發(fā)芽，但是溫度過高會導致胚芽發(fā)黃，生長不正常。20℃時，HB－AG、AH－BZ、HN－ZK和HN－XY荊芥種子的發(fā)芽率明顯高于10、30℃ 下的發(fā)芽率，特別是HB－AG荊芥種子發(fā)芽率能達到80%以上。所以可以看出，10、20℃分別能實現(xiàn)野生和栽培產(chǎn)地荊芥種子的正常萌發(fā)。

2.3 覆土厚度對不同產(chǎn)地荊芥種子萌發(fā)特性的影響

表4結(jié)果顯示，覆土厚度對6個產(chǎn)地荊芥種子發(fā)芽率均有顯著影響(p＜0.05)，不覆土或覆土0.5 cm厚有利于荊芥種子萌發(fā)。在適宜覆土厚度下，HB－AG荊芥種子的發(fā)芽率最高達到84.70%，顯著高于其余5個產(chǎn)地(p＜0.05)。

3 討論與結(jié)論

3.1 種子外在品質(zhì)的影響因素

種子外在品質(zhì)指標主要包括凈度、千粒質(zhì)量、含水量等。千粒質(zhì)量反映的是種子的成熟度、飽滿度。野生類型的JSTC荊芥種子千粒質(zhì)量明顯偏低，可能與采收時間有關(guān)，因為果穗偏綠，種子沒有完全成熟。所以用于生產(chǎn)種植的荊芥種子采收時間應當明確，以保障種子的質(zhì)量。種子含水量是影響在貯藏期間種子活力和活力保持的關(guān)鍵因素之一［5］。劉小麗等通過試驗發(fā)現(xiàn)，隨著種子含水量(10.04% ～3.54%)的下降，荊芥種子發(fā)芽率呈現(xiàn)出先下降后上升再迅速下降的總體趨勢，種子含水量為7.11% ～5.88%時，荊芥種子的發(fā)芽率較高，抗老化能力強［6］。對川牛膝和柴胡種子的研究也表明，適當降低種子含水量可以保持或者提高種子的發(fā)芽率［7－8］。2個野生產(chǎn)地荊芥種子含水量明顯高于除HN－XY之外的栽培產(chǎn)地，在20℃、pH值為6的條件下，野生產(chǎn)地荊芥種子發(fā)芽率則明顯低于栽培產(chǎn)地，種子含水量可能是影響因素之一。經(jīng)綜合比較可知，栽培類型的荊芥種子外在品質(zhì)優(yōu)于野生類型，且HB－AG荊芥種子的外在品質(zhì)為最優(yōu)。

影響藥用植物種子質(zhì)量的因素主要有生產(chǎn)區(qū)域的積溫、光照度、空氣濕度、土壤狀況、肥料供應、病蟲草害、采收時間等［9］。在人工栽培條件下，水肥充足，田間管理良好，藥用植物的營養(yǎng)生長和生殖生長能正常進行，加上合理的采收時間，所收獲的種子成熟度一致，品質(zhì)較好，發(fā)芽率高。而在野生條件下，較多不利的環(huán)境或者生物因素會影響藥用植物的生長，且采收時機不合理也會使藥用植物的種子質(zhì)量參差不齊。

3.2 荊芥種子萌發(fā)對溫度和pH值的響應

栽培和野生荊芥種子分別在20、10℃條件下實現(xiàn)正常萌發(fā)，30℃有利于種子的吸漲過程并促進發(fā)芽，卻不利于隨后的代謝活動，與高峰等認為的10～35℃荊芥種子萌發(fā)率均無顯著變化的研究結(jié)果［10］有所不同，原因可能是在不同產(chǎn)地，栽培和野生類型荊芥種子的萌發(fā)特性存在差異。目前在全國大部分地區(qū)均有種植荊芥，主要分布在河北、江蘇、浙江、江西、湖北、湖南和東北3省等地［11］，栽培分布地域跨度較大，種子萌發(fā)溫度適應范圍較廣，上述試驗結(jié)果也印證了這一點。

表4 不同覆土厚度下各產(chǎn)地荊芥種子的萌發(fā)率(n=3)

在本研究中，弱酸條件有利于荊芥種子的萌發(fā)，堿性條件荊芥種子不萌發(fā)。這可能是由于一定的弱酸條件有利于種皮的軟化，進而促進荊芥種子的發(fā)芽。堿性條件不利于荊芥種子的萌發(fā)，原因可能是堿性條件抑制了荊芥種子內(nèi)部與萌發(fā)有關(guān)的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活性，使胚乳分解速度減慢，導致種子萌發(fā)受阻［12］。丹參種子雖然具有較寬的適宜pH值范圍(pH值2～10)，但仍在pH值為6時，其種子的發(fā)芽率達到最高值［13］。對pH值小于6時荊芥種子的萌發(fā)情況還有待進一步探究。

3.3 荊芥種子萌發(fā)對覆土厚度的響應

覆土厚度對荊芥種子的萌發(fā)有顯著影響，排除種子自身成熟度的影響，不覆土或者覆薄土對荊芥種子萌發(fā)有利。其他唇形科藥用植物種子，例如丹參，若覆蓋腐殖土，最適覆土厚度為1.0 cm［13］。百里香種子播種時應將種子直接撒播，為使種子與土壤緊密接觸要用手輕拍，覆土厚度不宜超過0.5 cm，覆土越厚反而會降低出苗率［14］。在大田生產(chǎn)中，對于這類頂土能力弱的小粒種子，也可以嘗試用枯草覆蓋以提高發(fā)芽率［15］。在最適覆土厚度條件下，6個產(chǎn)地荊芥種子的萌發(fā)率相差較大，栽培類型的HB－AG荊芥種子發(fā)芽率明顯高于其他5個產(chǎn)地。結(jié)合外在品質(zhì)指標的綜合評價結(jié)果以及發(fā)芽溫度與pH值試驗結(jié)果得出，HB－AG荊芥種子質(zhì)量最好，適合應用于荊芥藥材的生產(chǎn)，但是野生種質(zhì)資源的保護工作也不容忽視。

3.4 結(jié)論

在本試驗中，傳統(tǒng)栽培區(qū)河北安國所產(chǎn)荊芥種子的質(zhì)量最優(yōu)，微酸條件和覆薄土適宜荊芥種子萌發(fā)，這個結(jié)論可以為荊芥的規(guī)范化栽培提供參考依據(jù)。