熊書， 孫厚良， 楊麗珊， 馬強(qiáng)， 李國(guó)利， 周大祥

(1. 重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 萬州 404120； 2. 重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 萬州 404100)

作為一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，MADS-box家族基因在真核生物中分布廣泛[1]。該家族基因AGLs系列不僅參與植物花器官的發(fā)育[2-3]，而且在果實(shí)的發(fā)育過程中也扮演著重要的作用[4-5]。

研究已發(fā)現(xiàn)，多種轉(zhuǎn)錄因子在影響種子發(fā)育的同時(shí)，對(duì)油脂的合成和積累具有重要的調(diào)控作用，如Fusca3(FUS3)、 ABI3 (ABSCISIC ACID INSENSITIVE3)、Leafy Cotyledon1，2(LEC1，LEC2)、WRINKLEDl(WRI1)和Dof (DNA binding with One Finger)等。這些基因的突變、過量表達(dá)或異位表達(dá)都會(huì)對(duì)植物種子發(fā)育和油脂等物質(zhì)的積累產(chǎn)生重要的影響。FUS3作為一種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控種子發(fā)育及參與油脂積累，對(duì)甘藍(lán)型油菜FUS3突變體的研究發(fā)現(xiàn)，抑制種子油脂合成導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量增加，參與脂肪酸修飾、蔗糖代謝和糖酵解的基因在突變體植株的發(fā)育種子中被下調(diào)表達(dá)[6]。在擬南芥中表達(dá)蓖麻的LEC2基因可使脂肪酸鏈延長(zhǎng)酶1表達(dá)上調(diào)，同時(shí)誘導(dǎo)甘油三酯的積累[7]。而衰老誘導(dǎo)擬南芥LEC2使脂肪酸和甘油三酯生物合成的相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而顯著提高葉部C20:1和C22:1脂肪酸的合成[8]。在種子發(fā)育早期，WRI1調(diào)控脂肪酸的從頭合成及糖酵解過程，完成了種子中糖代謝向脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)化，在種子發(fā)育中期通過延長(zhǎng)油脂生物合成可以提高擬南芥種子的油脂含量[9-10]。在萊茵衣藻中，超表達(dá)Dof型轉(zhuǎn)錄因子可增加轉(zhuǎn)基因藻中油脂的積累[11]。

通過油菜胚發(fā)育和油脂合成表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，我們發(fā)現(xiàn)AGL13基因在胚中表達(dá)較高，初步認(rèn)為該基因可能與油脂合成有關(guān)。本研究擬克隆甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)的AGL13基因，同時(shí)構(gòu)建AGL13的干擾載體，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定AGL13通過控制油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)油脂的合成，線索也為通過基因工程手段提高油菜油脂含量，改良油菜品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以Brassicanapuscv. Westar甘藍(lán)型油菜作為研究材料，實(shí)驗(yàn)所用的RNAi干擾質(zhì)粒和農(nóng)桿菌菌株GV3101由重慶大學(xué)基因工程中心提供。

1.2 方法

1.2.1 提取RNA與熒光定量PCR

以BnAGL13基因設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物AGL13-F：5′-GGAAGAGGGAGAGTGGAGAT-3′;AGL13-R：5′-TCAATTGTTCTTTCAACTCC-3′，引物由華大基因合成。利用OMEGA植物RNA提取試劑盒提取油菜各部位的RNA，利用Thermo Scientific First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，-80℃保存?zhèn)溆谩晒舛縋CR利用TaKaRa公司SYBR Green Ⅰ試劑盒，在CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行，分析BnAGL13基因在油菜不同組織的表達(dá)情況。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性20 s；95℃變性3 s，60℃退火30 s，60℃延伸15 s，39個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品5次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用2—△△Ct法計(jì)算。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

序列信息在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載，蛋白結(jié)構(gòu)域分析在http://pfam.wustl.edu/上進(jìn)行。利用ClustalX2.1比對(duì)蛋白質(zhì)序列，用MEGA 5構(gòu)建進(jìn)化樹, 構(gòu)樹方法為Construct/Test Neighbor-Joining Tree，利用SWISS MODEL(http://swiss model.expase.org)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，采用First approach mode建模，參考擬南芥的晶體模型。

1.2.3 干擾載體構(gòu)建

以油菜盛花后5 d的種子cDNA為模板，用BnAGL13的正向前后引物(For-BnAGL13-F: 5′-CCGCT

CGAGCGCAAGACACAAGTTATGAT-3′;For-BnAGL13-R: 5′-GGGGTACCGTAAAAAGGGTTCGGTGTTG-3′)擴(kuò)增出正向基因片段For-BnAGL13，將此片段以及RNAi載體用Xhol和Kpn1酶切，純化回收后連接到RNAi載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，酶切驗(yàn)證。反向前后引物(Rev-BnAGL13-F: 5′-GCTCTAGAGTAAAAAGGGTTCGGTGTTGC-3′; Rev-BnAGL13-R: 5′-CCCAAGCTTCGCAAGACACAAGTTATGAT-3′)操作同上，用XbaI和HindIII酶切載體。

At：擬南芥；Bn：甘藍(lán)型油菜

圖1 AGL13的氨基酸序列比對(duì)和同源性分析

Fig 1 Amino acid sequence alignment and homology analysis ofAGL13

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05說明差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白結(jié)構(gòu)分析

將甘藍(lán)型油菜與擬南芥的AGL13蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)分析，我們發(fā)現(xiàn)油菜的AGL13氨基酸序列與擬南芥同源性很高，二者都具有完整且典型的MADS-box保守結(jié)構(gòu)域(圖1)，對(duì)該蛋白的結(jié)構(gòu)功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有DNA結(jié)合位點(diǎn)，位于C端區(qū)域。許多研究發(fā)現(xiàn)，MADS-box家族基因在植物花和果實(shí)的發(fā)育過程中起著重要的作用，我們推測(cè)AGL13蛋白編碼的基因?qū)儆贛ADS-box家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

2.2 蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

SWISS MODEL在線分析蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)該蛋白為同源四聚體結(jié)構(gòu)，具有兩個(gè)α螺旋，螺旋之間為無規(guī)則卷曲，其整體形態(tài)呈現(xiàn)典型的DNA核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)(圖2)。表明該基因表達(dá)的蛋白質(zhì)為轉(zhuǎn)錄因子，具備典型的MADS-box保守結(jié)構(gòu)域，是MADS-box家族基因。

圖 2 SWISS MODEL三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

圖3 BnAGL13的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 進(jìn)化樹分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載蛋白序列，利用MEGA程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析BnAGL13蛋白和AtAGL蛋白的遺傳進(jìn)化關(guān)系。從圖3可知，BnAGL13蛋白與AtAGL13和AtAGL6蛋白組成一個(gè)小的亞家族，其中，BnAGL13蛋白與AtAGL13蛋白親源關(guān)系最近，說明BnAGL13可能與AtAGL13在功能上可能有一定的相似性。

2.4 定量PCR表達(dá)分析

我們分析了油菜各組織AGL13基因的組織表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGL13在各組織中均表達(dá)，其中在莖部表達(dá)水平最低，果夾15DAP時(shí)期表達(dá)水平最高，盛花期到種子45DAP表達(dá)水平都很高(圖4)，在果夾5DAP和果夾15DAP之間是油菜種子胚迅速膨大、油脂快速積累的時(shí)期，定量PCR的結(jié)果表明AGL13可能與油菜種子發(fā)育及油脂的合成密切相關(guān)。

DAP：盛花后的種子

圖4甘藍(lán)型油菜AGL13基因的組織表達(dá)模式分析

Fig 4 Analysis of tissue expression patterns ofBnAGL13 gene

圖5 RNAi干擾載體的構(gòu)建

2.5 干擾載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化油菜

為了進(jìn)一步驗(yàn)證AGL13在油菜種子發(fā)育及其油脂合成中可能具有重要的作用，我們采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)AGL13基因在油菜中的表達(dá)，觀察轉(zhuǎn)基因油菜的表型。在構(gòu)建RNA干擾載體時(shí)，我們首先以AGL13基因的cDNA作為模板，200 bp的干擾載體正向和反向片段分別被擴(kuò)增出來(圖5-A)，然后分別插入干擾載體中，獲得重組質(zhì)粒，進(jìn)一步酶切驗(yàn)證插入片段大小，發(fā)現(xiàn)插入片段為1000 bp(圖5-B)，與預(yù)期一致，證明RNAi載體已經(jīng)構(gòu)建成功。下一步我們將構(gòu)建好的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV310菌株中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法，用油菜下胚軸和子葉為受體，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，目前正在獲得陽(yáng)性抗性苗。隨后將進(jìn)一步獲得轉(zhuǎn)基因油菜植株，觀察轉(zhuǎn)基因油菜胚的發(fā)育和種子油脂的積累，確定AGL13在油菜胚的發(fā)育及油脂的合成中發(fā)揮著重要的作用。

3 討論

甘藍(lán)型油菜油廣泛應(yīng)用于人類消費(fèi)和工業(yè)生產(chǎn)，對(duì)更新、污染更小和廉價(jià)燃料資源的需求增加了對(duì)生物燃料生產(chǎn)的探索。有數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)菜籽油占食用植物油使用量的三分之一，而菜籽餅粕占植物餅粕使用量的四分之一，增加油菜產(chǎn)油率和油脂品質(zhì)改善始終是油菜育種的重要內(nèi)容。對(duì)單位面積產(chǎn)油量而言，油菜油脂含量每提高1%，相當(dāng)于增產(chǎn)菜籽2.5%。目前，我國(guó)主要的油菜品種含有40%左右的平均油脂含量，而國(guó)外一般油菜品種在42%～45%之間，部分甘藍(lán)型油菜品種油脂含量高達(dá)47%[12]。因此，我國(guó)油菜種植業(yè)經(jīng)濟(jì)效益低下，這必然會(huì)打擊農(nóng)民種植油菜的積極性，制約了進(jìn)一步擴(kuò)大油菜種植面積和油菜業(yè)的發(fā)展。為此，進(jìn)一步研究油菜油脂合成的分子調(diào)控機(jī)理，可以讓我們了解控制油脂合成的關(guān)鍵基因，為通過基因工程手段提高油菜油脂含量，改良油菜品質(zhì)，提高油菜產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)效益奠定基礎(chǔ)。

多種轉(zhuǎn)錄因子在影響種子發(fā)育的同時(shí)，對(duì)油脂的合成和積累具有重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥LEC2突變體改變了種子的化學(xué)組成，降低了油脂和蛋白質(zhì)含量，而淀粉和蔗糖含量反而增加[13]。在油菜中WRI1轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)植物開花，增強(qiáng)種子和葉組織的油脂積累，對(duì)植物生長(zhǎng)沒有明顯的抑制作用。該轉(zhuǎn)錄因子是通過降低貯藏的碳水化合物，增加可溶性糖來促進(jìn)脂質(zhì)代謝的碳通量，調(diào)節(jié)油脂積累和膜脂代謝之間的平衡[14]。而擬南芥種子發(fā)育中期，超表達(dá)WRI1將延長(zhǎng)油脂生物合成，提高油脂含量，且種子中油脂含量與蛋白質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)[15]。TTG1作為WRKY家族的一員，在調(diào)節(jié)擬南芥種子儲(chǔ)備營(yíng)養(yǎng)成分中起著重要的作用,FUS3可直接結(jié)合到TTG1基因組區(qū)域中，抑制種子的TTG1表達(dá)，從而調(diào)控脂肪酸成份及含量[16]。

定量PCR實(shí)驗(yàn)證明了AGL13基因在種子發(fā)育及油脂積累過程中表達(dá)強(qiáng)烈，表明該基因可能在這些發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將通過獲得抑制AGL13基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因油菜，并對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜進(jìn)行胚分析和油脂含量測(cè)定，觀察轉(zhuǎn)基因植株的種子及胚發(fā)育是否被強(qiáng)烈抑制，胚中的脂肪酸的含量是否顯著降低。通過上述研究，明確了AGL13基因在控制油菜種子中脂肪酸合成中的作用。