趙宏偉， 張瀟尹， 高恩軍

(1.沈陽(yáng)化工大學(xué) 遼寧省無(wú)機(jī)分子基化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 沈陽(yáng) 110142；2.波士頓學(xué)院， 麻薩諸塞州 波士頓 02467)

癌癥嚴(yán)重威脅人類的健康，尋找治療癌癥的藥物受到很多國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究者的關(guān)注.隨著對(duì)癌機(jī)理不斷地深入研究,已經(jīng)證明癌癥的發(fā)生不僅與外界環(huán)境有密切的關(guān)系,而且與人體內(nèi)的環(huán)境息息相關(guān).目前外界污染物質(zhì)的致癌機(jī)理還不完全清楚,但是一些間接致癌物通過(guò)人體的代謝轉(zhuǎn)化成為最終致癌物,并且和DNA相互結(jié)合,在人體內(nèi)持續(xù)存在可能是癌變的決定性因素，癌癥其特征是細(xì)胞不受控制的增殖和細(xì)胞凋亡的喪失，從而產(chǎn)生異常的細(xì)胞或腫瘤.傳統(tǒng)的癌癥治療主要是手術(shù)，化療和放療.盡管化療已被廣泛用于臨床治療，但在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥中存在許多缺點(diǎn)，例如順鉑的一般毒性，非特異性靶向和獲得性耐藥.為了減少化學(xué)治療藥物的不良反應(yīng)并提高治療效率，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注低毒性金屬配合物的研究和改善治療性能以用作抗腫瘤藥物[1].新型藥物與生命大分子作用機(jī)制是評(píng)價(jià)藥效的重要方法.研究認(rèn)為藥物的主要靶點(diǎn)是DNA.DNA作為細(xì)胞受體，在藥物切割DNA 和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡在致癌和癌癥治療中都起著重要作用.稀有金屬配合物可以調(diào)節(jié)對(duì)DNA 結(jié)合和切割能力，釔配合物已經(jīng)被提出用作潛在的抗癌和抑癌劑.本文以釔金屬離子與2,2′-聯(lián)吡啶-4,4′-二甲酸為配體，在水熱條件下進(jìn)行反應(yīng)，合成了金屬釔與氧原子結(jié)合的新穎的配合物，通過(guò)對(duì)配合物的熒光光譜技術(shù)和電泳技術(shù)，研究了聚合物與 DNA 的作用機(jī)制和對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制效果，并得出有價(jià)值的科學(xué)信息.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

2,2′-聯(lián)吡啶-4,4′-二甲酸(H2bpydc)，二甲基甲酰胺(DMF)，蒸餾水，魚精DNA(FS-DNA),溴化乙錠(EtBr),pBR322質(zhì)粒DNA，Tris-HCl,NaCl,CdCl2,均為分析純?cè)噭?，?gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

Bruker Smart 1000 CCD X-射線衍射儀，美國(guó)Bruker公司；Perkin-Elmer LS55熒光分光光度計(jì)，美國(guó)Perkin-Elmer公司；JY-SPAT水平電泳槽進(jìn)行電泳的測(cè)量.

1.2 配合物的合成與結(jié)構(gòu)表征

將每3份質(zhì)量的金屬鹽Y(NO3)3·6H2O與1份質(zhì)量的2,2′-聯(lián)吡啶-4,4′-二甲酸配體溶解在V(DMF)∶V(H2O)=1∶1的溶劑中，在常溫下攪拌至完全溶解，放置于100 ℃反應(yīng)釜中加熱3 d.用溶劑洗滌分離合成的晶體，并至于空氣中干燥得到純凈的晶體.產(chǎn)率:42.7 %.元素分析[理論值(實(shí)驗(yàn)值)，w/%]:C,19.55(19.61); H,4.07(4.11); N,11.41(11.43); Y,18.12(18.12).

選擇尺寸為0.22 nm×0.20 nm×0.18 nm的配合物單晶，以石墨單色器Mo Ka為靶源(λ=0.071 073 nm)的Brucker Smart單晶衍射儀上,以ω-2θ的方式檢測(cè)在2.04°<2θ<24.93°的范圍之內(nèi)的衍射數(shù)據(jù)，使用SHELXTL-2013軟件程序進(jìn)行晶體數(shù)據(jù)的解析，配合物的晶體信息列于表1.

表1 晶體數(shù)據(jù)

1.3 熒光光譜法

通過(guò)熒光光譜法研究配合物與DNA之間的相互作用.通常研究DNA與配合物的方法是熒光猝滅光譜.EtBr(溴化乙錠)在熒光光譜法的研究中是熒光探針和DNA插入劑[2].在水溶液中EtBr分子自身熒光性很弱，然而在DNA作用下恰恰相反.將新穎的配合物加入到EtBr-DNA的體系中，發(fā)現(xiàn)配合物與EtBr競(jìng)爭(zhēng)取代與DNA插入結(jié)合的EtBr分子，熒光在競(jìng)爭(zhēng)作用下部分或者全部猝滅，然而猝滅的程度與金屬配合物和EtBr對(duì)DNA的競(jìng)爭(zhēng)能力息息相關(guān)[3].因此可以通過(guò)熒光光譜法判斷配合物與DNA的結(jié)合強(qiáng)弱.

1.4 凝膠電泳法

凝膠電泳法是根據(jù)分子的特征應(yīng)用物理特性分離分子的一種實(shí)驗(yàn)方法，同時(shí)也是測(cè)定金屬配合物對(duì)DNA是否發(fā)生了切割或嵌入、解旋的作用方法[4].利用瓊脂糖和聚丙烯酰胺不同濃度的配比分離相對(duì)質(zhì)量或相同相對(duì)質(zhì)量不同構(gòu)型的核酸片段.對(duì)于小的核酸分子，通常使用不同濃度配制的不同孔徑的聚丙烯酰胺凝膠，而瓊脂糖凝膠則用于分離分子量大的核酸.此外，利用低濃度的熒光嵌入溴化乙錠進(jìn)行染色，可以準(zhǔn)確地知道DNA在凝膠中的具體位置[5].使用超螺旋質(zhì)粒DNA pBR322作為靶點(diǎn)，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)配合物的切割效率.當(dāng)切割環(huán)形質(zhì)粒DNA時(shí)，超螺旋形式(Form I)將觀察到有最快的遷移；如果一條鏈被切割，超螺旋將變得松弛是以產(chǎn)生較慢移動(dòng)的切口圓形(Form Ⅱ)；而如果兩條鏈都被切割，則會(huì)產(chǎn)生在其間遷移的線性形式(Form Ⅲ).最后，對(duì)超螺旋pBR322 DNA從Ⅰ型轉(zhuǎn)化為Ⅱ型和Ⅲ型的能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)[6].

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物[Y2(H2bpydc)3·H2O]的結(jié)構(gòu)

圖1所示是配合物Y2(H2bpydc)3·H2O的單體配位環(huán)境結(jié)構(gòu)圖.由圖1可以看出：中心釔離子是八配位的，其中中心金屬釔與2,2′-聯(lián)吡啶-4,4′-二甲酸6個(gè)配體中的氧相連，剩余的2個(gè)氧為游離氧原子.而2,2-聯(lián)吡啶-5,5-二羧酸是一個(gè)剛性配體，2個(gè)六元環(huán)彼此平行，2個(gè)氮原子由于分布兩側(cè)，配位能力減弱，在此配合物中并未參與配位.合成的新穎釔的化合物結(jié)合時(shí)形成一個(gè)完全對(duì)稱的結(jié)構(gòu).

圖1 晶體配位環(huán)境

2.2 熒光光譜法

溴化乙錠(EtBr)是一種具有平面分子的熒光染色劑，其高度靈敏的共軛芳香環(huán)具有較弱的熒光作用，它的共軛扁平分子平行地嵌入DNA雙鏈的配對(duì)堿基對(duì)之間形成堆積[7-8].沒(méi)有熒光性質(zhì)的DNA在插入EtBr后，不僅平行地固定在DNA內(nèi)部，而且使其內(nèi)部平行面剛性加強(qiáng).發(fā)生碰撞猝滅減小，熒光特性明顯增強(qiáng)[9].金屬配合物或化合物也能與 DNA 發(fā)生類似的插入作用，它會(huì)與DNA 相結(jié)合的 EtBr 產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)釋放出 EtBr，復(fù)合體中的EtBr發(fā)出的熒光比游離的EtBr本身發(fā)出的熒光強(qiáng)度大10倍，從而導(dǎo)致熒光性減弱.在激發(fā)波長(zhǎng)為526 nm，DNA-EtBr復(fù)合體系與配合物作用的發(fā)射光譜圖(最大發(fā)射峰為618 nm)如圖2所示.圖2中6條譜線分別表示：1為溶液中僅存在DNA-EtBr復(fù)合體系的熒光曲線，2～6為DNA-EtBr復(fù)合體系分別加入濃度不斷增加的配合物(0.5×10-6mol/L,1.0×10-6mol/L,1.5×10-6mol/L,2.0×10-6mol/L,2.5×10-6mol/L)的熒光曲線.在用EtBr預(yù)處理的DNA上加入配合物后，觀察到熒光強(qiáng)度明顯降低，且加入的配合物濃度越高，猝滅現(xiàn)象越明顯.還原程度不僅與DNA中除去溴化乙錠的配合物的量度有關(guān)，而且還與相鄰的DNA堿基對(duì)和配合物之間的作用程度有關(guān).這既能說(shuō)明藥物以插入方式與DNA相作用，又能研究藥物與DNA結(jié)合能力的強(qiáng)弱.根據(jù)經(jīng)典斯特恩-沃爾默(Stern-Volmer)方程[10]：

I0/I=1+Ksq·r

其中：I,I0分別代表配合物/EtBr/DNA復(fù)合物中存在和不存在配合物時(shí)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度；Ksq表示斯特恩猝滅常數(shù)，定性描述配合物與DNA的作用強(qiáng)弱；r為復(fù)合物中配合物與DNA的濃度比.從圖3可以看出：Ksq大小可以定量地比較兩個(gè)化合物在同等條件下與DNA作用的強(qiáng)弱程度，Ksq越大，作用程度越強(qiáng).經(jīng)過(guò)計(jì)算得出化合物的Ksq=0.211 8.

1.c(配合物)=0 mol·L-1

圖3 Stern-Volmer猝滅曲線

2.3 凝膠電泳法

配合物對(duì)DNA進(jìn)行了有效的切割，形成了多條條帶，其中通過(guò)使用配合物的3種不同濃度研究了切割超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA.由圖4可以看出：DNA可以被水溶性釔配合物切割.隨著釔配合物濃度的降低，切割活性依次減弱，這里可以看出配合物可誘導(dǎo)所有濃度的質(zhì)粒DNA進(jìn)行明顯切割，但是配合物濃度不同的情況下，其對(duì)質(zhì)粒DNA顯示出不同的切割效率.對(duì)于不存在金屬配合物的對(duì)照，觀察到少量DNA裂解[11].

凝膠電泳法是將一定濃度的pBR322質(zhì)粒DNA和新穎的配合物溶液放置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8 %的瓊脂糖凝膠上(并且使用EtBr進(jìn)行著色)，由此測(cè)定新穎的配合物切割DNA能力的強(qiáng)弱，在200 V、80 mA條件下，將配合物放在TAE緩沖溶液的電泳池中，反應(yīng)一段時(shí)間后標(biāo)注相應(yīng)濃度下的圖譜，如圖4所示.Lane 1～4顯示的是配合物濃度依次為 14.0、 7.0、3.5、0 μmol/L在有氧條件下，反應(yīng)2 h的新穎配合物對(duì)DNA進(jìn)行切割結(jié)果圖像.從電泳圖中可以看出：隨著配合物濃度的減小，F(xiàn)ormⅠ在增加而FormⅡ在減小(除參照Lane 4外).由此可以得出配合物對(duì)DNA具有一定的切割能力.

圖4 配合物對(duì)pBR322 DNA的切割電泳圖譜

3 結(jié) 論

(1) 用2,2′-聯(lián)吡啶-4,4′-二甲酸配體與六水硝酸釔通過(guò)水熱反應(yīng)制得新穎的釔配合物Y2(H2bpydc)3·H2O，配體2,2′-聯(lián)吡啶-4,4′-二甲酸中的羧酸與一個(gè)釔金屬相結(jié)合，形成多配位的金屬配合物.

(2) 通過(guò)熒光光譜法表明2,2′-聯(lián)吡啶-4,4′-二甲酸-釔配合物與DNA的作用方式為嵌插作用，Stern-Volmer線性猝滅常數(shù)Ksq為0.211 8.使用瓊脂糖凝膠電泳研究了配合物切割超螺旋質(zhì)粒DNA pBR322的能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明配合物表現(xiàn)出有效的DNA切割能力.實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明配合物與DNA有較強(qiáng)的相互作用.通過(guò)本文的研究希望能夠?yàn)榘邢蛐运幬锏脑O(shè)計(jì)和體外藥物的篩選提供理論依據(jù)與技術(shù)支持.