西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041

西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所民族藥物新藥研發(fā)課題組在高原民族藥(藏藥)生發(fā)復(fù)方“扎頡俄色”的前期研究中發(fā)現(xiàn)，“扎頡俄色”有效部位總黃酮提取物(ZJESF)較原復(fù)方具有更好的局部活化毛囊促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用[1-3]。但是，ZJESF溶解性較差，皮膚透過(guò)性差，藥物直接應(yīng)用于皮膚的療效不明顯。醇質(zhì)體(Ethosomes)是由磷脂、高濃度(20%～45%)乙醇和水組成，具有脂質(zhì)雙分子層囊泡結(jié)構(gòu)的一種新型柔性脂質(zhì)體[4]。易于透過(guò)皮膚屏障，有效地?cái)y帶藥物到達(dá)皮膚深層細(xì)胞，促進(jìn)藥物透皮吸收，因而可顯著提高藥物的經(jīng)皮滲透速率以及藥物在皮膚內(nèi)的滯留量，是一種較為理想的透皮載體。因此，本研究計(jì)劃將ZJESF制備成一種新型局部外用醇質(zhì)體[5]，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出一種安全、有效、生物利用度高、具有毛囊皮脂腺靶向作用的治療脫發(fā)疾病的新型外用制劑提供質(zhì)量可靠的醇質(zhì)體中間體。本文進(jìn)行ZJESF醇質(zhì)體的處方、制備工藝優(yōu)化和質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器、Waters 2996 Empower色譜工作站，美國(guó)Waters公司)；MS-2000激光粒度分析儀(英國(guó)malvern公司)；KQ-250B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；JSM-7500F掃描電鏡(日本電子株式會(huì)社)；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器(上海廣英儀器有限公司)；ZF-I型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；SENCO-R型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)。

1.2 材料 甲醇(AR)、膽固醇(AR)、蛋黃卵磷脂(AR)、三氯甲烷(AR)、無(wú)水乙醇(AR)、二氯甲烷(AR)，甲基纖維素(AR)、羧甲基纖維素鈉(AR)、磷酸二氫鉀(AR)、磷酸氫二鉀等均為成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)；ZJESF(總黃酮)(批號(hào)：20160508，總黃酮含量為60%，西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所提供)；俄色黃酮(SFH)對(duì)照品(批號(hào)：20160106，純度>98%，西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所提供)。甲醇為色譜純(迪馬公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 SFH含量測(cè)定方法的建立及驗(yàn)證

2.1.1 供試溶液的制備

2.1.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取SFH對(duì)照品100 mg，置于100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得到濃度為 1 mg/mL 的儲(chǔ)備液。

2.1.1.2 供試品溶液的制備 精密量取ZJESF醇質(zhì)體溶液2.0 mL，加45%乙醇溶液稀釋定容至25 mL，搖勻，精密吸取1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，超聲破膜，搖勻， 即得供試品儲(chǔ)備液。

2.1.1.3 空白溶液的制備 采用注入法制備不含ZJESF的空白醇質(zhì)體，精密量取ZJESF醇質(zhì)體溶液2.0 mL，加45%乙醇溶液稀釋定容至25 mL，搖勻，精密吸取1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，超聲破膜，搖勻， 即得空白液溶。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 取對(duì)照品儲(chǔ)備液，以甲醇做作為空白，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，根據(jù)掃描結(jié)果選擇 285 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Phenomenor Luna C18柱(250 mm×4.6 mm 5 μm)；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：285 nm；流動(dòng)相：甲醇-水(2∶3)。體積流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.4 專(zhuān)屬性考察 取“2.1.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液、空白溶液及供試品溶液，0.45微孔濾膜過(guò)濾，HPLC法測(cè)定其吸收峰。結(jié)果，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下，空白脂質(zhì)體無(wú)吸收，說(shuō)明輔料對(duì)主藥的測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果 SFH的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于 10 000。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.1.1 .1”項(xiàng)下SFH對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于 20 mL 量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，按色譜條件進(jìn)樣，于 1 d 內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定測(cè)定其峰面積，結(jié)果顯示RSD%值為0.24(n=6)，表明方法精密度良好。

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1.1”項(xiàng)下SFH對(duì)照品儲(chǔ)備液，并將儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度為10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL 的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，按色譜條件進(jìn)樣， HPLC法測(cè)定其峰面積，濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察其線性關(guān)系。得線性方程為Y=3×107X+865115(R2=0.9995)，結(jié)果表明：SFH在0.010～0.100 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.7 穩(wěn)定性考察 精密量取“2.1.1.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品和SFH對(duì)照品儲(chǔ)備液，室溫放置1、2、4、6、8、12、24、48、72 h 后，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果，兩者RSD%分別為1.3%和2.4%，表明標(biāo)準(zhǔn)溶液在 72 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取6份已知含量的醇質(zhì)體溶液，分別精密加入SFH對(duì)照品20.0 mg，制備加樣回收供試品溶液，照“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算回收率。平均回收率98.0%，RSD%為1.6。

2.1.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一份 ZJESF醇質(zhì)體，按照供試品溶液的制備方法平行制備 6 份，分別注入液相色譜儀，驗(yàn)證方法的精密度，測(cè)定得其RSD為0.94%。

2.2 ZJESF醇質(zhì)體的制備工藝和處方研究及結(jié)果

2.2.1 ZJESF醇質(zhì)體的制備 根據(jù)參考文獻(xiàn)[6-7]和預(yù)試結(jié)果采用注入法制備醇質(zhì)體。通過(guò)單因素篩選工藝條件，得醇質(zhì)體制備工藝如下：精密稱(chēng)取處方量的ZJESF、蛋黃卵磷脂、膽固醇，加入處方量無(wú)水乙醇溶解并定容，構(gòu)成有機(jī)相；另取一定量純化水加入混合容器中，置于磁力攪拌器(700 r/min)上，構(gòu)成水相。將有機(jī)相用注射器針頭緩慢加入至水相中，注完后繼續(xù)攪拌2 h，攪拌溫度保持在50℃，自然冷卻后超聲20 min， 即得[8]。

2.2.2 ZJESF醇質(zhì)體的處方及工藝優(yōu)選 依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果，選擇對(duì)ZJESF醇質(zhì)體制劑包封率影響較大且規(guī)律不明顯的3個(gè)因素，即卵磷脂與藥物比(A)、卵磷脂與膽固醇比(B)，醇濃度(C)、3個(gè)因素都取3個(gè)水平，并以包封率為主要優(yōu)化指標(biāo)，在“2.2.1”的基礎(chǔ)上采用L9(34) 正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行制備工藝及處方的篩選[9]。

取蛋黃卵磷脂與ZJESF比例(w/w)、蛋黃卵磷脂與膽固醇比例(w/w)、含醇量3個(gè)因素水平進(jìn)行處方及工藝優(yōu)選，因素水平見(jiàn)表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平表

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析表明，按積差R的大小排列，各因素對(duì)ZJESF醇質(zhì)體包封率的影響程度依次為： A = C>B。蛋黃卵磷脂與藥物比(A)和醇濃度(C)，兩者影響程度相當(dāng)，而蛋黃卵磷脂與膽固醇比(B)影響程度最小。所以，結(jié)合單因素考察結(jié)果，A2B2C1為最優(yōu)條件，得到最佳處方及工藝為：ZJESF為5%、蛋黃卵磷脂與藥(ZJESF)比為8∶1(w/w)、含醇量為45%(v/v)、蛋黃卵磷脂與膽固醇比為3∶1(w/w)PBS溶液。精密稱(chēng)取處方量的ZJESF、蛋黃卵磷脂、膽固醇，加入處方量無(wú)水乙醇溶解并定容，構(gòu)成有機(jī)相；另取一定量純化水加入混合容器中，置于磁力攪拌器(700 r/min)上，構(gòu)成水相。將有機(jī)相緩慢加入至水相中，加完后繼續(xù)攪拌2 h，攪拌溫度保持在50℃，自然冷卻后超聲20 min，即得。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

2.2.3 粒徑和Zeta電位的測(cè)定和形態(tài)觀察 取優(yōu)化方案制備的ZJESF醇質(zhì)體適量，適當(dāng)稀釋后，采用激光粒徑分析儀分別測(cè)定ZJESF醇質(zhì)體的以粒子體積為權(quán)重的重量平均粒徑分布和Zeta電位。由粒徑分布和Zeta電位可以得出，ZJESF醇質(zhì)體的平均粒徑為(296.6±5.8) nm，(PDI值0.26)，Zeta電位為(-14.4±2.3) mV。

取優(yōu)化方案制備的ZJESF醇質(zhì)體少量，用PBS溶液稀釋200倍，將稀釋樣品超聲5 min，使其均勻分散；用毛細(xì)管將樣品滴于導(dǎo)電膠上，置于烤燈下烘干(溫度低于50℃)；將導(dǎo)電膠粘到載物臺(tái)上，固定好并噴金；置于JSM-7500F型掃描電鏡下觀察其外觀形態(tài)。制備的ZJESF醇質(zhì)體為均一乳白色混懸液，無(wú)沉淀，無(wú)分層。如圖1所示，該ZJESF醇質(zhì)體外觀呈球狀或類(lèi)球型，粒徑大小適中。

2.2.4 醇質(zhì)體包封率的測(cè)定 采用超離心法測(cè)定醇質(zhì)體的包封率：精密移取ZJESF醇質(zhì)體 2 mL于離心管中，于4℃下離心， 10 000 r/min 離心 30 min，取上清液，補(bǔ)足溶劑(與處方量相同濃度的乙醇水溶液)，同條件下再次離心，合并上清液測(cè)定上清液ZJESF量(mL)；另取醇質(zhì)體混懸液0.1 mL 于 10 mL 容量瓶中，甲醇定容，超聲15 min 破膜，測(cè)得總藥量(m)，包封率按下式計(jì)算： p 包封率 (%) = (1- mL/m)×100%。采用高速離心法測(cè)定最佳處方最佳制備工藝制備的醇質(zhì)體三批，得到其包封率分別為72.4%、72.6%、71.6%，因此得到SFZH醇質(zhì)體平均包封率為72.2%。

2.2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 三批ZJESF醇質(zhì)體(工藝驗(yàn)證規(guī)格為：50 mL)樣品工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)結(jié)果表明，三批ZJESF醇質(zhì)體樣品的平均包封率為71.3%，RSD為1.5%(n=3)，與正交實(shí)驗(yàn)值相當(dāng)，表明工藝合理、可行。

表3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

3 討論

影響醇質(zhì)體包封率的因素有很多，如藥物的性質(zhì)、藥物與脂質(zhì)的比例、醇和脂質(zhì)的種類(lèi)和用量、制備方法等。其中，醇質(zhì)的制備方法最常用的為注入法和薄膜分散法。考慮到薄膜分散法會(huì)存在有機(jī)溶劑殘留、制膜薄厚不均勻及不宜工業(yè)化生產(chǎn)的問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)選用注入法。以ZJESF醇質(zhì)體的包封率為指標(biāo)，通過(guò)單因素考察和正交優(yōu)化法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定ZJESF醇質(zhì)體制備的最佳處方及最佳工藝參數(shù)[6]。由單因素考察可知：藥物量、超聲時(shí)間、攪拌速度及制備溫度對(duì)包封率、粒徑、電位的影響不是很大，綜合考慮各方面的因素，藥物量定為5%，超聲時(shí)間定為20 min，攪拌速度定為700 r/min。卵磷脂與主藥比例、卵磷脂與膽固醇比例、含醇量對(duì)包封率影響較大且規(guī)律不明顯，將3個(gè)因素作為正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化法考察的因素，繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行考察。