方慶，李璟，王利

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.成都理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院，四川 成都 610059）

白細(xì)胞介素（interleukin）是指在白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用的淋巴因子，可以傳遞信息，激活、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞并介導(dǎo)T、B細(xì)胞增殖與分化，在炎癥反應(yīng)中也起重要作用。IL-8和IL-10是其中的重要組成部分，在炎癥反應(yīng)和免疫方面發(fā)揮著極其重要的作用[1-2]。IL-8屬于CXC型趨化因子，具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)與有絲分裂和刺激血管生成等作用，與多種疾病及衰老都有密切的聯(lián)系，在免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤方面也具有極其重要的作用，并且是評(píng)價(jià)動(dòng)物免疫功能的重要指標(biāo)[3]。IL-10作為一種多效價(jià)細(xì)胞因子在腫瘤、炎癥和免疫性疾病等多種疾病中也發(fā)揮著重要的作用。IL-10在具有免疫抑制作用的同時(shí)也具有免疫刺激作用，可以促進(jìn)B細(xì)胞的增殖、分化和MHCⅡ類(lèi)分子表達(dá)，阻止B細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)各種免疫球蛋白類(lèi)別的轉(zhuǎn)換和非單核細(xì)胞依賴(lài)性T細(xì)胞的成熟與增殖，是重要的抑制性細(xì)胞因子[4]。

枯草芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌是我國(guó)農(nóng)業(yè)部第105號(hào)公告公布的允許使用的益生菌飼料添加劑，因其具有無(wú)抗藥性、適應(yīng)性強(qiáng)，能耐受高濃度的有機(jī)廢水和較強(qiáng)的分解轉(zhuǎn)化能力，不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)在養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中使用廣泛[5]。目前，已有關(guān)IL-8及IL-10的研究多偏重于對(duì)腫瘤因子的影響，而關(guān)于益生菌對(duì)鯽魚(yú)相關(guān)基因影響的文章鮮有報(bào)道。該試驗(yàn)采用RT-PCR方法，選用沼澤紅假單胞桿菌、復(fù)合菌種（枯草芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌）對(duì)鯽魚(yú)的兩個(gè)基因表達(dá)的影響的不同狀況，推測(cè)益生菌對(duì)鯽魚(yú)炎癥反應(yīng)和免疫功能的作用，為深入研究鯽魚(yú)免疫應(yīng)答反應(yīng)、炎癥發(fā)生及益生菌的推廣使用，提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中所用枯草芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌，由該試驗(yàn)室制備培養(yǎng)，經(jīng)分子鑒定后于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。試?yàn)用鯽魚(yú)購(gòu)于成都某市場(chǎng)，體長(zhǎng)（15.7±2.3）cm，體質(zhì)量（115.2±13.8）g。營(yíng)養(yǎng)瓊脂（Nutrient Agar；北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。2×Long Tap Mix酶、DNA Marker DL2000購(gòu)自北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。Yeast Extract、Tryptone、Trizol（Invitrogen公司產(chǎn)品），凝膠回收試劑盒（Axygen公司產(chǎn)品）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組

選取大小均勻，生長(zhǎng)狀況良好的鯽魚(yú)90尾，分成3組。A組空白對(duì)照組，B組添加沼澤紅假單胞菌，C組添加沼澤紅假單胞菌和枯草芽孢桿菌按照1：1混合制成的復(fù)合菌。兩組菌均添加至水中。每隔3天進(jìn)行菌液的添加，至終濃度活菌量為2.1×107cfu/ml，試驗(yàn)養(yǎng)殖時(shí)間為30 d。試驗(yàn)每隔10 d，每缸隨機(jī)選取3尾鯽魚(yú)，采集上述3尾試驗(yàn)鯽魚(yú)的脾臟和腎臟組織，液氮速凍后迅速將樣品放入-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取總RNA及合成cDNA

利用Trizol法提取試驗(yàn)魚(yú)脾臟和腎臟樣品的總RNA[6]，用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，并使用FastQuant反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將獲得的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的鯽魚(yú)IL-8和IL-10基因全序列，以β-actin為內(nèi)參基因。利用Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，并用Oblige 6.0檢驗(yàn)，序列為：IL-8上游引物 5'-CTTAGAGGACTGGGTGTA-3'，下游引物5'-GTTATCTTCAGGGTTGC-3'。IL-10上游引物5'-GACACCATTCTGCCAACA-3'，下游引物5'-GCGAACTCAAAGGGATT-3'。β-actin上游引物5'-CAAGATGATGGTGTGCCAAGTG-3'，下游引物5'-TCTGTCTCCGGCACGAAGTA-3'。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：dd H2O 10 μL，2×Taq PCR Master Mix 13 μL，上游引物（10μmol/L）0.9 μL，下游引物（10 μmol/L）0.9 μL，cDNA 模板 1.2 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min；94℃30 s，適宜TM值30 s，72 ℃ 40 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。IL-8、IL-10 和β-actin的TM值分別為46℃，52℃和56℃。用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，最后在80 V電壓下電泳30 min，觀察結(jié)果并凝膠成像系統(tǒng)記錄。

2 結(jié)果分析

2.1 總RNA的提取及檢測(cè)

經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，A組、B組和C組中脾臟和腎臟（10 d、20 d和 30 d）RNA 28S、18 S 條帶單一清晰，分光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280值在1.8～2.0之間。由此RNA質(zhì)量及完整性較好，符合試驗(yàn)要求。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.1 IL-8表達(dá)結(jié)果

IL-8的序列長(zhǎng)度為143 bp，β-actin序列長(zhǎng)度為120 bp，由圖1～圖3可知，IL-8在各時(shí)間段的不同組織內(nèi)均有表達(dá)。在組別上，圖1 IL-8在C組脾臟中表達(dá)量比A、B兩組低，在B組腎臟中的表達(dá)量比A、C兩組高；圖2 IL-8在各組組織中的表達(dá)量無(wú)明顯差異；圖3 IL-8在各組組織中均有較高表達(dá)。在時(shí)間段上，20 d的表達(dá)量最低，而30 d的表達(dá)量最高。

圖1 IL-8在不同組織中的表達(dá)（10 d）

圖2 IL-8在不同組織中的表達(dá)（20 d）

圖3 IL-8在不同組織中的表達(dá)（30 d）

2.2.2 IL-10表達(dá)結(jié)果

IL-10的序列長(zhǎng)度為146 bp，β-actin序列長(zhǎng)度為120 bp。由圖4～圖6可知，IL-10在各時(shí)間段的不同組織內(nèi)均有表達(dá)。在組別上，圖4 IL-10在C組脾臟和腎臟中表達(dá)量均比A、B兩組高；圖5 IL-10在各組組織中的表達(dá)量均較低；圖6 IL-10在脾臟中的表達(dá)量均無(wú)明顯變化，在B、C組腎臟中的表達(dá)量均比A組高。在時(shí)間段上，20 d的表達(dá)量最低，而30 d的表達(dá)量最高。

圖4 IL-10在不同組織中的表達(dá)（10 d）

圖5 IL-10在不同組織中的表達(dá)（20 d）

圖6 IL-10在不同組織中的表達(dá)（30 d）

3 討論

益生菌對(duì)于提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫能力和抗體水平的報(bào)道已有許多[7]。沼澤紅假單胞菌和枯草芽孢桿菌均屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用菌種，能夠促進(jìn)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)和相關(guān)免疫。研究發(fā)現(xiàn)向青蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中分別添加硝化細(xì)菌制劑、芽孢桿菌制劑及硝化細(xì)菌和芽孢桿菌復(fù)合菌劑，結(jié)果顯示，青蝦平均體質(zhì)量硝化細(xì)菌+芽孢桿菌組增長(zhǎng)最多，硝化細(xì)菌組稍大于芽孢桿菌組，空白組最少[8]。微生物制劑能夠促進(jìn)腸胃營(yíng)養(yǎng)成分吸收，從而使黃顙魚(yú)的生長(zhǎng)加快[9]。魚(yú)類(lèi)飼料中添加枯草芽孢桿菌能提高團(tuán)頭魴的可抗氧功能，增強(qiáng)集體的防御能力，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體健康[10]。在羅非魚(yú)飼料中添加沼澤紅假單胞菌，羅非魚(yú)死亡率明顯低于對(duì)照組，抗病效果顯著[11]。

飼料中添加殼寡糖可以促進(jìn)青魚(yú)IL-8和IL-10基因的表達(dá)[12]。雙氣三聯(lián)活菌減少了IL-10KO小鼠的結(jié)腸炎癥，降低了促炎細(xì)胞因子的分泌[13]。益生菌乳酸菌的脂質(zhì)酸在豬小腸上皮細(xì)胞中能降低聚I：c（聚肌胞苷酸）誘導(dǎo)的IL-8的生成，從而抑制病毒致病性炎癥反應(yīng)[14]，2株乳酸菌抑制Escherichia coli K88對(duì)促炎癥因子APRIL分泌的誘導(dǎo)作用并促進(jìn)Escherichia coli K88感染的腸上皮細(xì)胞分泌IL-10[15]。屎腸球菌可以保護(hù)腸上皮細(xì)胞，并能減弱腸上皮細(xì)胞中ETEC（產(chǎn)腸毒素大腸桿菌）誘導(dǎo)的IL-8分泌[16]。該試驗(yàn)復(fù)合菌組（C組）基因IL-8在腎臟和脾臟的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（A組），說(shuō)明適當(dāng)添加復(fù)合菌對(duì)鯽魚(yú)免疫功能的提高有明顯的影響。IL-10在腎臟中表達(dá)量高于對(duì)照組，說(shuō)明沼澤紅假單胞菌能提高鯽魚(yú)的免疫功能，其作用機(jī)理可能與上述機(jī)制相似。而基因IL-10在鯽魚(yú)脾臟中表達(dá)結(jié)果相似，可能是因?yàn)镮L-10在脾臟中自身表達(dá)較低，也可能是益生菌對(duì)于脾臟中基因的影響不大，或者與不同菌種的有效成分或者作用方式不同有關(guān)，也或者與菌種的選擇或益生菌配比比例有關(guān)，其根本原因需要進(jìn)一步研究。

該試驗(yàn)IL-8基因在B組和C組中的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。該研究中第20天時(shí)B組和C組的IL-8、IL-10基因的表達(dá)量明顯低于第10天和第30天，造成這種差異的原因可能與試驗(yàn)周期長(zhǎng)短、溫度應(yīng)激有關(guān)，一定時(shí)期內(nèi)使用免疫增強(qiáng)劑反而會(huì)使機(jī)體免疫功能下降，可能是魚(yú)體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)存在一種負(fù)反饋機(jī)制。因此，有必要研究益生菌的有效免疫期，也可以作為該試驗(yàn)基因的表達(dá)量隨時(shí)間改變而有所改變的試驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，該試驗(yàn)從基因水平探討了益生菌對(duì)鯽魚(yú)脾臟和腎臟中IL-8及IL-10基因表達(dá)的影響。這為深入研究益生菌對(duì)鯽魚(yú)免疫機(jī)制的影響提供參考，也為益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供科學(xué)資料。