曾穎，朱新儒，余壘，李雄，張海德

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

番木瓜（Carica papaya L.）原產(chǎn)于墨西哥南部以及鄰近的美洲中部地區(qū)。在我國(guó)主要分布在廣東、海南、廣西、云南、福建、臺(tái)灣等?。▍^(qū)）。木瓜蛋白酶（papain）是存在于番木瓜的根、莖、葉和果實(shí)內(nèi)的一種低特異性蛋白水解酶，其中在未成熟的乳汁中含量最豐富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，屬于含巰基（-SH）肽鏈內(nèi)切酶，它具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等特點(diǎn)，因此在食品[1]、醫(yī)藥[2]、飼料[3]、日化[4]、皮革[5]及紡織[6]等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。木瓜蛋白酶是100%的天然物質(zhì)，因此在食品及飲料工業(yè)上有獨(dú)特的廣闊發(fā)展前途[7]。

離子液體，又稱低溫熔融鹽，是指在室溫或接近室溫下呈現(xiàn)液態(tài)的、完全由陰陽(yáng)離子所組成的鹽。由于離子液體具有非常獨(dú)特的理化性能，非常適合于用作分離提純的溶劑。2003年，Gutowski等采用親水性離子液體1-丁基-3-甲基咪唑鹽酸鹽（[Bmim]Cl）和磷酸鉀（K3PO4）首次提出了離子液體雙水相體系這一概念。離子液體雙水相相較于傳統(tǒng)雙水相既為蛋白質(zhì)的萃取營(yíng)造了溫和的環(huán)境，又避免了萃取過(guò)程中有機(jī)溶劑的使用，具備萃取率高、兩相界面清晰、黏度低、綠色環(huán)保、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。因此近年來(lái)在分離生物活性物質(zhì)方面迅速發(fā)展并在分離生物活性物質(zhì)[8-9]方面被廣泛研究。

本試驗(yàn)利用離子液體雙水相對(duì)木瓜中的木瓜蛋白酶進(jìn)行分離純化，旨在從方法上尋求新的突破，為木瓜蛋白酶的純化提供更多的理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶（BR，>2 000 U/mg）：生工生物（上海）股份有限公司；[C2mim]Ac、[C4mim]Ac、[C6mim]Ac、[C8mim]Ac：蘭州雨陸精細(xì)化工有限公司；K2HPO4（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用有限責(zé)任公司；DK-98-1型恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；HJ-5型多功能恒溫?cái)嚢杵鳎撼Ｖ萑A奧儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)測(cè)定方法

用Bradford法[10]來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，1.0 mL樣液加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染色液5.0 mL，反應(yīng)5 min左右在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：A595=0.007x+0.000 5，R2=0.999 2。

1.3.2 雙節(jié)線的測(cè)定

在295.15 K的條件下采用濁點(diǎn)法制作雙節(jié)線[11]。分別配制一定濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%左右）的離子液體溶液于大試管中，逐滴加入一定濃度的鹽溶液，直到溶液剛好變渾濁，記下消耗的鹽溶液體積。再加入重蒸水使溶液澄清，重復(fù)上述操作。計(jì)算出在溶液渾濁時(shí)離子液體和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)繪制相圖。

1.3.3 分配系數(shù)測(cè)定

配制一定量的的離子液體、無(wú)機(jī)鹽和木瓜蛋白酶溶液，震蕩混勻后以5 000 r/min離心10 min，讀取上下

式中：cT和cB分別為雙水相體系中上下相的蛋白酶的濃度，mg/mL。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

離子液體側(cè)鏈烷基對(duì)分配系數(shù)的影響：以相圖為指導(dǎo)，用不同的離子液體配制相同質(zhì)量組成的雙水相，固定離子液體和K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為25%、18%，加入等量適量的酶液，測(cè)定木瓜蛋白酶的分配系數(shù)。

離子液體濃度對(duì)分配系數(shù)的影響：配制離子液體濃度為20%、24%、28%、32%、36%，K2HPO4濃度固定為18%的雙水相，加入等量適量的酶液，測(cè)定木瓜蛋白酶的分配系數(shù)。

K2HPO4濃度對(duì)分配系數(shù)的影響：保持[C8mim]Ac濃度為24%不變，根據(jù)相圖，選取K2HPO4濃度為16%、18%、20%、22%、24%的雙水相體系。加入等量適量的酶液，測(cè)定木瓜蛋白酶的分配系數(shù)。

pH值對(duì)分配系數(shù)的影響：雙水相pH值分別調(diào)節(jié)為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，K2HPO4濃度為 18%，[C8mim]Ac濃度為24%，加入等量適量的酶液，測(cè)定木瓜蛋白酶的分配系數(shù)。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)離子液體濃度（A）、鹽濃度（B）、pH值（C）這3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以分配系數(shù)（K）作為考察指標(biāo)，獲得木瓜蛋白酶的最佳條件萃取條件。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。相的體積，測(cè)定上下相的蛋白濃度，分配系數(shù)（K）的計(jì)算公式如下：

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM（response surface methodology）

2 結(jié)果與分析

2.1 雙節(jié)線的測(cè)定及關(guān)聯(lián)

本試驗(yàn)研究了[Cnmim]Ac（n=2，4，6，8）和 K2HPO4的相形成能力，[Cnmim]Ac（n=4，6，8）與 K2HPO4的相圖見(jiàn)圖1。

圖1 [Cnmim]Ac（n=4，6，8）與 K2HPO4的相圖Fig.1 Phase diagram of the[Cnmim]Ac（n=4，6，8）with K2HPO4

雙節(jié)線越靠近原點(diǎn)，則成相能力越好，從圖1可以看出咪唑類醋酸鹽的成相能力為：[C8mim]Ac>[C4mim]Ac>[C6mim]Ac。一般情況下離子液體陽(yáng)離子側(cè)鏈烷基越長(zhǎng)，則離子液體疏水性越強(qiáng)，更容易形成雙水相。而[C2mim]Ac難以與K2HPO4形成雙水相。

用Merchuk[12]方程對(duì)雙節(jié)線數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)。

式中：WIL、WS分別表示離子液體和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；a、b、c為方程參數(shù)。雙節(jié)線數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 雙節(jié)線數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)結(jié)果Table 2 Binodal correlation results

由表2，可以看出對(duì)雙節(jié)線數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)效果非常好。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 離子液體側(cè)鏈烷基對(duì)分配系數(shù)的影響

以相圖為指導(dǎo)，用3種離子液體配制相同質(zhì)量組成的雙水相，固定離子液體和K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為25%、18%，加入等量適量的酶液，結(jié)果如圖2所示。

木瓜蛋白酶的分配系數(shù)隨著離子液體陽(yáng)離子側(cè)鏈烷基的增加而增大。咪唑類醋酸鹽離子液體的疏水性隨側(cè)烷基鏈增長(zhǎng)緩慢加強(qiáng)，因此長(zhǎng)鏈烷基可能更有利于木瓜蛋白酶被萃取到上相中。因此，選取萃取效果最好的[C8mim]Ac來(lái)進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.2 離子液體濃度對(duì)分配系數(shù)的影響

離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化對(duì)木瓜蛋白酶分配行為的影響見(jiàn)圖3。

圖2 離子液體烷基側(cè)鏈變化對(duì)木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig.2 Effects of the alkyl chain length of ionic liquids on the partition behavior

圖3 離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化對(duì)木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig.3 Effects of the mass of ionic liquids on the partition behavior

固定K2HPO4濃度為18%，配制[C8mim]Ac濃度為20%、24%、28%、32%、36%的雙水相，由圖3可知K值先上升后下降，在[C8mim]Ac濃度為28%時(shí)取得最大值11.44。隨著[C8mim]Ac濃度增加（>28%），富含離子液體的上相體積也會(huì)增加，雖然可能對(duì)酶的萃取量變大了，但是上相酶濃度也會(huì)隨上相體積的變大而降低，所以總體的K值開(kāi)始下降。

2.2.3 K2HPO4濃度對(duì)分配系數(shù)的影響

K2HPO4濃度變化對(duì)木瓜蛋白酶分配行為的影響見(jiàn)圖4。

圖4 K2HPO4濃度變化對(duì)木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig.4 Effects of the mass of K2HPO4on the partition behavior

于是保持[C8mim]Ac濃度為28%不變，選取K2HPO4濃度為16%、18%、20%、22%、24%。圖4得出，K值先增大后減小，這可能是因?yàn)镵2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加導(dǎo)致了鹽析作用增強(qiáng)，木瓜蛋白酶轉(zhuǎn)移到上相。但是同時(shí)上相的水分子慢慢減少，與蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基形成氫鍵能力減弱，當(dāng)[C8mim]Ac濃度過(guò)大時(shí)上相的黏度增加，也會(huì)阻礙木瓜蛋白酶的轉(zhuǎn)移能力。

2.2.4 pH值對(duì)分配系數(shù)的影響

pH值變化對(duì)木瓜蛋白酶分配行為的影響見(jiàn)圖5。

圖5 pH值變化對(duì)木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig.5 Effects of pH on the partition behavior

根據(jù)圖5得知：隨pH值的增大，K呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢(shì)，并在pH=9時(shí)取得最大值。pH值對(duì)離子液體雙水相中酶分配系數(shù)的影響是通過(guò)酶與成相物質(zhì)之間的氫鍵效應(yīng)和電荷效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。蛋白質(zhì)作為兩性分子，其帶電性質(zhì)受介質(zhì)值的影響[13]。當(dāng)pH值大于等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，與的離子液體的咪唑陽(yáng)離子之間發(fā)生靜電作用。咪唑類離子液雙水相體系中，蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基與離子液體陽(yáng)離子之間的疏水相互作用是萃取分離蛋白質(zhì)的主要?jiǎng)恿14]。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)離子液體濃度（A）、鹽濃度（B）、pH 值（C）這 3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，以分配系數(shù)（K）作為考察指標(biāo)。根據(jù)響應(yīng)而分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of RSM

續(xù)表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Continue table 3 Experimental design and results of RSM

2.3.2 回歸模型建立及顯著性分析

利用軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到分配系數(shù)K的二次多項(xiàng)式回歸模型如下：

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析和回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表4和表5所示。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis for the regression model

表5 回歸模型的顯著性檢驗(yàn)Table 5 Significance test for the regression model

模型的失擬項(xiàng)均不顯著（P=0.479 9>0.05），說(shuō)明方程對(duì)試驗(yàn)擬合度很好?；貧w方程與實(shí)測(cè)值之間的擬合度可以通過(guò)相關(guān)系數(shù)（R2）和校正決定系數(shù)（Adj.R2）來(lái)解釋。方程3的相關(guān)系數(shù)為99.7%，說(shuō)明模型實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值之的擬合度都非常好。校正決定系數(shù)為99.31%，說(shuō)明該回歸模型可以解釋99.31%的數(shù)據(jù)的變異性，因此可利用該模型對(duì)分配系數(shù)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

從回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值大小可評(píng)價(jià)該因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響程度[15]。方程2顯示，各因素對(duì)分配系數(shù)K的影響順序?yàn)閜H值>[C8mim]Ac的質(zhì)量分?jǐn)?shù)>K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在該水平范圍內(nèi)，AB、BC、AC、A2、B2、C2對(duì)K的影響極顯著，A、B對(duì)K的影響顯著。

2.3.3 響應(yīng)曲面分析

在回歸分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)回歸方程擬合繪制響應(yīng)面圖，如圖6所示。

圖6 分配系數(shù)K的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Responsive surface and contour plot of partition coefficient K

兩因素間交互作用的強(qiáng)弱可以通過(guò)等高線圖來(lái)判斷，若等高線為圓形，則表示兩者交互作用不顯著，等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明交互作用顯著[16-17]。AC的交互作用較AB、BC而言對(duì)K的影響最為顯著。

2.3.4 最優(yōu)萃取條件的確定及模型驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，得出 [C8mim]Ac-K2HPO4系統(tǒng)萃取木瓜蛋白酶的最佳萃取條件為：離子液體[C8mim]Ac濃度為28.03%，K2HPO4濃度為20.08%，pH值為8.55，此時(shí)分配系數(shù)K的預(yù)測(cè)值為11.65。按照優(yōu)化條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)以考察模型的可靠性，得分配系數(shù)的平均值為11.85，與預(yù)測(cè)值11.65非常接近，相差僅為1.69%。

3 結(jié)論

在同樣的條件下，分別測(cè)定 [Cnmim]Ac（n=2、4、6、8）離子液體和K2HPO4的成相能力，[C8mim]Ac的成相效果比[C4mim]Ac、[C6mim]Ac都要好。利用Merchuk方程對(duì)雙節(jié)線數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，相關(guān)系數(shù)都大于0.99，說(shuō)明關(guān)聯(lián)效果非常好，這為進(jìn)一步試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)各單因素的考察可知，[C8mim]Ac的萃取效果優(yōu)于[C6mim]Ac和[C4mim]Ac，然后釆用響應(yīng)面法優(yōu)化離子液體濃度、鹽濃度、pH值這3個(gè)因素，最佳條件下分配系數(shù)可以達(dá)到11.65。與預(yù)測(cè)值11.85非常接近，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化的提取條件可靠。