劉婉迪，王 威，謝 倩，陳清西

溫度是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素，不適宜的溫度極易影響植物的生理代謝，由于細(xì)胞膜對(duì)溫度有較高的靈敏性［1］，過(guò)高的溫度會(huì)造成細(xì)胞膜組織結(jié)構(gòu)性損傷［2］。J.K.Raison［3］等提出膜脂相變理論后，許多研究證明原生質(zhì)膜透性的變化主要在于質(zhì)膜的變化［4-5］。因此，通過(guò)測(cè)定植物組織電解質(zhì)外滲率變化情況，可以判斷植物是否受到高溫脅迫以及脅迫程度。電導(dǎo)法配合Logistic方程計(jì)算植物高溫半致死溫度(LT50)的測(cè)定方法簡(jiǎn)便、靈敏，已應(yīng)用于馬鈴薯［6-7］、油茶［8］、紫花苜蓿［9］、景天植物［10］、梨［11-12］、菊花［13］、白楊［14］、核桃［15］等多種植物材料，認(rèn)為其能夠準(zhǔn)確地對(duì)植物耐寒和耐熱性作出正確的判斷。杜鵑(Rhododendron)是杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑屬的常綠花灌［16］。杜鵑品種繁多、花色豐富，具有較高的觀賞與經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其生長(zhǎng)適宜溫度為12～25℃，多分布于較高海拔地區(qū)。目前栽培的大多數(shù)杜鵑優(yōu)良品種的耐熱性較差，溫度超過(guò)35℃時(shí)，新梢和新葉生長(zhǎng)緩慢，進(jìn)入半休眠狀態(tài)［17］，夏季高溫成為制約其生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因子。福建省夏季炎熱潮濕，最高氣溫可達(dá)40℃，限制了大量?jī)?yōu)良杜鵑品種在園林綠化中的應(yīng)用。因此，篩選和選育耐熱杜鵑品種，對(duì)于擴(kuò)大其在園林綠化的應(yīng)用具有重要意義。本研究通過(guò)在福建省多個(gè)地區(qū)調(diào)查，選擇9個(gè)福建地區(qū)暢銷的杜鵑品種進(jìn)行高溫脅迫處理，利用電導(dǎo)法配合Logistic方程，求得高溫半致死溫度(LT50)、細(xì)胞傷害率，而后結(jié)合人工氣候箱模擬高溫脅迫觀察這些品種的表型變化、計(jì)算相應(yīng)的褐變指數(shù)，對(duì)其進(jìn)行正確性驗(yàn)證，從而對(duì)9個(gè)品種杜鵑進(jìn)行耐熱排序，篩選出較適宜在福建地區(qū)園林綠化中應(yīng)用的耐熱品種，為生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

9個(gè)供試杜鵑品種(圖 1)，由永根杜鵑花培育有限公司提供。試驗(yàn)于2016年3月在福建農(nóng)林大學(xué)園藝設(shè)施溫室內(nèi)進(jìn)行。挑選4年生扦插苗，栽植于塑料花盆中(長(zhǎng)×寬×高為20 cm×20 cm×30 cm)，于溫室中適應(yīng)性栽培3個(gè)月后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致、無(wú)病蟲害的植株進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞傷害率與高溫半致死溫度的測(cè)定與計(jì)算 細(xì)胞傷害率的測(cè)定參照岑維亞［18］的方法。處理溫度與細(xì)胞傷害率用Logistic方程:y=k/(1+ae－bt)擬合，方程中y代表細(xì)胞傷害率，t代表處理溫度，k，a，b為方程參數(shù)，k為細(xì)胞傷害率的飽和容量，b表示x與y之間的函數(shù)關(guān)系，a反映方程曲線與原點(diǎn)之間的相對(duì)位置關(guān)系［19］。為了確定a、b的值，將Logistic方程:y=k/(1+ae－bt)進(jìn)行線性化轉(zhuǎn)化處理，ln［(k－y)/y］=lna－bt，令 y1=ln［(k－ y)/y］，則轉(zhuǎn)化為細(xì)胞傷害率(y1)與處理溫度(t)的直線方程。求回歸方程的二階導(dǎo)數(shù)，并令其等于零，即可獲得曲線拐點(diǎn)d2y/d2x的x值，即 ln a/b，其值為高溫半致死溫度(LT50，℃)。

1.2.2 高溫脅迫條件下表型指標(biāo)的觀測(cè) 將上述盆栽扦插苗置于人工氣候箱中，脅迫溫度為50℃(晝/夜)，光照強(qiáng)度為 150 μmol·m－2·s－1，每個(gè)處理3株，重復(fù)3次。相對(duì)濕度90%～95%，連續(xù)處理直至所有植株葉片枯萎，每12 h拍照和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。脅迫期間時(shí)刻關(guān)注土壤水分的變化，及時(shí)澆水，防止干旱導(dǎo)致的脅迫，影響數(shù)據(jù)真實(shí)性。根據(jù)李英慧［20］的方法稍作改變計(jì)算葉片褐變指數(shù)，將葉片的褐變狀態(tài)分為6級(jí)(表1)。統(tǒng)計(jì)褐變指數(shù)=［∑(褐變級(jí)值×相應(yīng)褐變級(jí)值株數(shù))/(總株數(shù)×褐變最高級(jí)值)×100%］。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析法 利用 SPSS 19.0和 Graphpad prism7.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與聚類分析，數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)方法采用Duncans New Multiple Range test(P＜0.05)和 One-Way ANOVA。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片細(xì)胞傷害率與脅迫溫度的關(guān)系

當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，葉片細(xì)胞膜遭到破壞、電解質(zhì)外滲，導(dǎo)致植物細(xì)胞浸提液的電導(dǎo)率增大。一般認(rèn)為植物耐熱性與高溫脅迫后細(xì)胞浸提液的電導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)。在不同溫度處理?xiàng)l件下，隨著溫度的升高，9個(gè)品種葉片的傷害率呈現(xiàn)“緩慢增加-急劇增加-緩慢增加”的趨勢(shì)，即典型的“S”形曲線。

圖1 9個(gè)參試杜鵑品種表型Fig.1 Morphological characteristics of 9 Rhododendron cultivars

表1 杜鵑葉片褐變指數(shù)分級(jí)Table 1 Grades of leaf browning index of Rhododendron

在40～45℃區(qū)間內(nèi)，9個(gè)杜鵑品種的細(xì)胞傷害率增加緩慢，表明此溫度區(qū)間內(nèi)，杜鵑葉片能自主調(diào)節(jié)并且維持細(xì)胞穩(wěn)定;在45～50℃溫度區(qū)間時(shí)，9個(gè)品種的相對(duì)電導(dǎo)率均呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)，其中‘霞紅’的增幅最大為 96.75%，‘天章’的增幅最小(39.16%)。‘御代之榮’和‘霞紅’在50℃水浴處理后，細(xì)胞傷害率達(dá)到 90%以上;‘白丹麥’、‘粉五寶’、‘春詩(shī)’和‘大青蓮’在55℃時(shí)，細(xì)胞傷害率達(dá)到90%以上;而‘石巖’、‘琉球紅’和‘天章’在60℃時(shí)，細(xì)胞傷害率達(dá)到90%以上(圖2)。

圖2 杜鵑各品種細(xì)胞傷害率與處理溫度間的關(guān)系Fig.2 Relationships between cell injured rate treatment and temperature in Rhododendron cultivars

2.2 高溫半致死溫度的確定

計(jì)算得出的9個(gè)杜鵑品種的轉(zhuǎn)化細(xì)胞傷害率和處理溫度間的關(guān)系見圖3?？梢钥闯觯霹N在不同溫度(t)下的細(xì)胞轉(zhuǎn)化傷害率(y1)的分布趨近一條直線(P＜0.01)，說(shuō)明 y1與 t之間的關(guān)系用Logistic方程是合適的。高溫半致死溫度與杜鵑耐熱性呈正相關(guān)，9個(gè)品種的高溫半致死溫度范圍在46～54℃，耐熱性排序依次為:‘石巖’＞‘琉球紅’＞‘白丹麥’＞‘天章’＞‘春詩(shī)’＞‘大青蓮’＞‘粉五寶’＞‘御代之榮’＞‘霞紅’。其中高溫半致死溫度最高的品種為‘石巖’，53.84℃，最低的品種為‘霞紅’，46.92℃，與‘石巖’相差7℃左右，具有較明顯的差異(表2)。

圖3 杜鵑各品種轉(zhuǎn)化細(xì)胞傷害率與處理溫度間的關(guān)系Fig.3 Relationship between converted rate of injured cells and treatment temperature in Rhododendron cultivars

表2 杜鵑各品種高溫下相對(duì)電導(dǎo)率回歸方程及高溫半致死溫度(LT50)Table 2 Logistic equations of relative electrolyte leakage and their high semi-lethal temperature(LT50)of Rhododendron cultivars

2.3 高溫脅迫時(shí)長(zhǎng)對(duì)杜鵑各品種葉片褐變指數(shù)和表型的影響

不同品種在一定時(shí)間范圍內(nèi)隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片褐變指數(shù)呈上升的趨勢(shì)，在12 h脅迫后，‘霞紅’大約50%左右葉片完全枯萎。當(dāng)脅迫時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)，‘霞紅’完全死亡，其他8個(gè)品種葉片均遭受不同程度的損傷，葉片逐漸由Ⅲ級(jí)損傷向Ⅳ級(jí)和Ⅴ級(jí)損傷轉(zhuǎn)變。當(dāng)脅迫時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)，‘大青蓮’、‘粉五寶’和‘御代之榮’完全死亡，剩余6個(gè)品種葉片大多處于Ⅴ級(jí)褐變狀態(tài)。當(dāng)36 h脅迫后，‘天章’、‘白丹麥’和‘春詩(shī)’全部死亡，‘石巖’和‘琉球紅’均處于Ⅴ級(jí)和Ⅵ級(jí)脅迫狀態(tài)。當(dāng)48 h脅迫后，‘石巖’和‘琉球紅’完全死亡。通過(guò)褐變指數(shù)以及表型變化可對(duì)供試品種的耐熱性進(jìn)行排序:‘石巖’＞‘琉球紅’＞‘天章’＞‘白丹麥’＞‘春詩(shī)’＞‘大青蓮’＞‘粉五寶’＞‘御代之榮’＞‘霞紅’。結(jié)合褐變指數(shù)可知，一定的高溫處理下，隨著高溫脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)，供試各品種葉片對(duì)高溫抵抗能力不同，說(shuō)明不同杜鵑品種葉片細(xì)胞膜對(duì)高溫脅迫的反應(yīng)有差異，對(duì)高溫傷害的響應(yīng)不同;同一品種隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片的褐變指數(shù)逐漸上升，但上升速度有不同，表明高溫對(duì)其的傷害有一個(gè)躍變過(guò)程(圖4、圖5)。

2.4 不同品種耐熱性的聚類分析

將9個(gè)杜鵑品種的高溫半致死溫度和褐變指數(shù)數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換后，采用平方歐氏距離，用離差平方和法對(duì)杜鵑不同品種的耐熱性進(jìn)行了系統(tǒng)聚類分析(圖6)，在歐式距離2.50處可將9個(gè)品種分為3類，第Ⅰ類群包括:‘石巖杜鵑’、‘琉球紅’為強(qiáng)耐熱品種，平均半致死溫度為53.28℃;第Ⅱ類包括:‘天章’、‘春詩(shī)’、‘白丹麥’和‘大青蓮’為中等耐熱品種，平均半致死溫度為51.49℃;第Ⅲ類包括:‘粉五寶’、‘御代之榮’和‘霞紅’，平均半致死溫度為47.60℃。

3 結(jié)論與討論

圖5 高溫脅迫時(shí)長(zhǎng)對(duì)杜鵑各品種表型的影響Fig.5 Effects of different heat treatment time on morphological characteristics in Rhododendron cultivars

圖6 杜鵑各品種的耐熱性聚類分析Fig.6 Cluster analysis of heat tolerance in Rhododendron cultivars

逆境脅迫導(dǎo)致植物細(xì)胞質(zhì)膜選擇性喪失，電解質(zhì)和某些有機(jī)物大量滲漏［21］。植物細(xì)胞膜的穩(wěn)定性是其抗逆性鑒定的重要指標(biāo)，有研究表明高溫脅迫下的植物變異與其本身的表現(xiàn)一致［12］。以細(xì)胞傷害率擬合Logistic方程計(jì)算得到的高溫半致死溫度(LT50)可較準(zhǔn)確地反映植物的耐熱性差異［22］，該方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，已有效地在多個(gè)植物中得到證實(shí)［5，22-25］。但是王文舉［26］等認(rèn)為由于半致死溫度和細(xì)胞傷害率是在離體條件下測(cè)定的，不一定能確切反映出植物的耐熱性。因此，本試驗(yàn)通過(guò)采用人工氣候箱集中高溫脅迫觀測(cè)9個(gè)品種的表型以及比較葉片的褐變指數(shù)進(jìn)一步對(duì)9個(gè)品種的耐熱性進(jìn)行排序，以期驗(yàn)證高溫半致死溫度對(duì)杜鵑耐熱性排序的準(zhǔn)確性。研究表明，高溫脅迫后杜鵑的細(xì)胞傷害率曲線呈現(xiàn)“S”形，通過(guò)顯著性檢驗(yàn)，符合Logistic方程。高溫半致死溫度在褐變指數(shù)的驗(yàn)證下，能客觀反映杜鵑品種的耐熱性，且所得到的耐熱性排序與半致死溫度排序一致，說(shuō)明通過(guò)計(jì)算高溫半致死溫度來(lái)判斷杜鵑的耐熱能力差異是有效的。通過(guò)對(duì)高溫半致死溫度以及對(duì)人工氣候箱的表型分析相結(jié)合，可以較為合理的為杜鵑的耐熱性育種及其在福建低海拔地區(qū)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。其中‘石巖’和‘琉球紅’具有較強(qiáng)的耐熱性，可以嘗試應(yīng)用于福建地區(qū)的園林綠化中。

隨著脅迫溫度的增加，胞質(zhì)外滲非持續(xù)進(jìn)行，外滲電導(dǎo)值變化在總趨勢(shì)升高的基礎(chǔ)上有變緩或急劇增加的情況［27］。本試驗(yàn)中，9個(gè)品種杜鵑在40℃和45℃時(shí)，其細(xì)胞傷害率值變緩或下降，是植物在逆境傷害初期的自我保護(hù)作用，這時(shí)細(xì)胞膜的損傷是可逆的，可以通過(guò)自主調(diào)節(jié)維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性進(jìn)行主動(dòng)運(yùn)輸，從而調(diào)整胞質(zhì)的外滲，導(dǎo)致外滲電導(dǎo)值變緩或下降。但通過(guò)對(duì)測(cè)定品種葉片的電導(dǎo)值變化幅度可見，這種自我保護(hù)在不同杜鵑品種上表現(xiàn)不同，與不同品種的細(xì)胞對(duì)高溫的應(yīng)激反應(yīng)的不同有關(guān)［11］。與張文娟［10］等對(duì)景天植物的耐熱性的研究以及石永紅［5］等對(duì)黑麥草的耐熱性的研究中一致。而當(dāng)超過(guò)一定溫度范圍時(shí)，供試杜鵑的細(xì)胞膜受到嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞膜可逆的損傷開始向不可逆的損傷轉(zhuǎn)變［26］。且不同品種的杜鵑細(xì)胞傷害率急劇增加的轉(zhuǎn)折點(diǎn)均不同。在50℃和55℃脅迫后，9個(gè)品種的細(xì)胞傷害率均呈現(xiàn)緩慢增加或保持不變的趨勢(shì)，說(shuō)明此時(shí)質(zhì)膜已經(jīng)遭到破壞，主動(dòng)運(yùn)輸功能完全喪失，電導(dǎo)值下降。

綜上所述，高溫下，隨著高溫脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)，供試各品種葉片對(duì)高溫抵抗能力不同，且溫度對(duì)其傷害有一個(gè)躍變過(guò)程。褐變指數(shù)所得出的耐熱性與高溫半致死溫度所得到的耐熱性基本一致，說(shuō)明高溫半致死溫度可以作為評(píng)價(jià)杜鵑耐熱性的準(zhǔn)確方法。根據(jù)高溫半致死溫度和褐變指數(shù)對(duì)杜鵑的耐熱性進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，9個(gè)品種可分為3類，第Ⅰ類群包括:‘石巖’、‘琉球紅’為強(qiáng)耐熱品種;第Ⅱ類包括:‘天章’、‘春詩(shī)’、‘白丹麥’和‘大青蓮’為中等耐熱品種;第Ⅲ類包括:‘粉五寶’、‘御代之榮’和‘霞紅’為不耐熱品種。