楊忠順 林易凡

（廣東省深圳中學(xué) 廣東深圳 518001）

“觀察DNA 和RNA 在細(xì)胞中的分布”是課程標(biāo)準(zhǔn)必修1“活動(dòng)建議”里的一個(gè)重要實(shí)驗(yàn)［1］。 該實(shí)驗(yàn)原理是利用甲基綠、 吡羅紅與DNA 和RNA的親和力不同， 將DNA 與RNA 分別染成綠色和紅色。染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，綠色主要分布在細(xì)胞核，紅色主要分布在細(xì)胞質(zhì)，從而讓學(xué)生得出DNA 主要分布在細(xì)胞核中， 而RNA 主要分布在細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)論。

1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的問題

教材設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)，材料來源容易，適于大多數(shù)地區(qū)采用［2］。實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)，即使嚴(yán)格根據(jù)教材的步驟操作，許多學(xué)生仍觀察不到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使用人口腔上皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)， 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)情況下細(xì)胞核也被染成紅色，不能達(dá)到區(qū)分DNA與RNA的效果； 而用洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，教材并未給出詳細(xì)步驟，參照口腔上皮細(xì)胞，不經(jīng)酒精燈烘烤，30℃條件下用8%鹽酸解離5 min 后再染色， 發(fā)現(xiàn)洋蔥表皮細(xì)胞細(xì)胞核也十分容易被染成紅色， 而且還有質(zhì)壁分離的現(xiàn)象出現(xiàn)。 此外，使用預(yù)混的甲基綠-吡羅紅染料（由公司購買，在保質(zhì)期內(nèi)使用），直接進(jìn)行染色，鏡檢過程中會(huì)發(fā)現(xiàn)有大量深色顆粒，影響觀察。

使用8%鹽酸解離易使細(xì)胞核也染成紅色的問題，康思婷的研究結(jié)果提到了多種可能［3］。首先鹽酸解離過程中易使DNA 變形，其次是pH 值對(duì)染料染色的影響，最后是DNA 在高溫條件下易變性。 俞如旺等的研究結(jié)果顯示，烤干與烘干，經(jīng)過鹽酸解離都會(huì)使細(xì)胞核染為紅色［4］。 而不經(jīng)鹽酸解離， 使用中性的生理鹽水或pH 值在7.35 左右的磷酸緩沖液環(huán)境承載口腔上皮細(xì)胞， 染色均不受影響（后文中有相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明）。 因此判斷使細(xì)胞核染為紅色的原因， 可能主要在于鹽酸解離過程中導(dǎo)致的DNA 變形，DNA 由于變形解旋為單鏈，使得其與吡羅紅的親和力大幅增加，而與甲基綠的親和力則大幅下降。

之前的文獻(xiàn)報(bào)道中提出的解決方案主要包括取消鹽酸解離的步驟或用醋酸緩沖液代替。 在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)取消鹽酸解離的步驟， 直接染色的確能夠達(dá)到一定的效果， 但是對(duì)于人類口腔上皮細(xì)胞和洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，染色較淺且不穩(wěn)定，偶有染不上色的情況； 對(duì)于洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞， 撕取的0.5 cm×0.5 cm的內(nèi)表皮， 染色中易浮在染液液滴之上，導(dǎo)致染色不均勻。

2 Triton X-100 作為透膜劑的探究實(shí)驗(yàn)

Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）分子量為646.86，分子式為C34H62O11，是一種非離子型表面活性劑。在生物學(xué)和工業(yè)生產(chǎn)中常用作去垢劑，以增加細(xì)胞膜的通透性， 還能在此過程中保持膜蛋白的天然構(gòu)象。 Triton X-100 易購買，pH 值為中性， 性質(zhì)非常穩(wěn)定， 常溫下避光可以長時(shí)間保存。 基于以上原因，筆者嘗試探究TritonX-100 作為此實(shí)驗(yàn)的透膜劑。

為了探究Triton X-100 作為透膜劑改善染色效果， 筆者設(shè)計(jì)了2 組實(shí)驗(yàn)分別探究Triton X-100 在“觀察DNA 和RNA 在細(xì)胞中的分布”實(shí)驗(yàn)中的使用濃度和透膜時(shí)間。 實(shí)驗(yàn)材料選取更易觀察的洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞。

參考免疫細(xì)胞化學(xué)中的動(dòng)物細(xì)胞透膜濃度，設(shè)置3 個(gè)Triton X-100 實(shí)驗(yàn)組別， 濃度分別為0.1%、1%和10%， 除此之外還有8%鹽酸解離組別和不解離的對(duì)照組。

表1 洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞在不同條件下的解離

制備pH 值為7.35 左右的磷酸緩沖液（PBS）稀釋Triton X-100， 稀釋濃度分別為0.1%、1%和10%，其中0.5%～1%為免疫細(xì)胞化學(xué)中透膜的常用濃度， 而梯度兩端的濃度在設(shè)置上分別與常用濃度相差一個(gè)數(shù)量級(jí)， 以驗(yàn)證過低或過高濃度對(duì)透膜的影響。 而在溫度選擇上，由于Triton X-100常作為表面活性劑使用， 應(yīng)用中無需加熱， 因此Triton X-100 的透膜選取室溫進(jìn)行，透膜時(shí)間5 min。透膜后使用清水緩慢沖洗10 s，然后染色。染色過程5 min，染色后用濾紙吸去多余染液，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下觀察。 不解離對(duì)照組撕取洋蔥內(nèi)表皮后直接染色，吸去多余染液后鏡檢。

結(jié)果如圖1所示， 細(xì)胞核只有鹽酸解離組別呈紅色， 不解離與Triton X-100 透膜組別均為藍(lán)綠色，而細(xì)胞質(zhì)不解離組別著色最淺，隨著Triton X-100 濃度的增加， 著色越來越深，10% Triton X-100 組細(xì)胞質(zhì)已呈現(xiàn)為偏綠色， 而鹽酸解離組別質(zhì)壁分離明顯，細(xì)胞質(zhì)皺縮。 綜合上述結(jié)果，0.1%～1%的Triton X-100 均能在不影響細(xì)胞核著色的前提下，使細(xì)胞質(zhì)著色加深，故Triton X-100比較適宜的使用濃度為0.1%～1%。

圖1 不同Triton X-100 透膜濃度對(duì)洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞染色的影響

在確定Triton X-100 的適宜使用濃度后，繼續(xù)探究Triton X-100 透膜時(shí)間對(duì)洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞染色的影響。 共設(shè)置4 個(gè)時(shí)間梯度，分別為2min、5min、10min 和15min， 透膜后染色鏡檢過程同上述步驟。染色結(jié)果如圖2所示，隨著透膜時(shí)間的增加，細(xì)胞核的顏色變化不大，均成綠色，而細(xì)胞質(zhì)顏色則越來越深， 說明透膜時(shí)間的增加可以使染料更有效的結(jié)合RNA。 考慮到實(shí)驗(yàn)課時(shí)間有限，染色時(shí)間控制在5min 比較合適，且能達(dá)到較好的透膜效果。

隨后驗(yàn)證Triton X-100 在人類口腔上皮細(xì)胞染色中的作用。 用1%濃度的Triton X-100 透膜5 min（用1% 的Triton X-100 PBS 溶液代替生理鹽水，透膜后在烘箱中烘干，染色時(shí)間均為5 min）與直接染色相比，結(jié)果如圖3所示，透膜組胞質(zhì)著色偏紅，直接染色組胞質(zhì)著色較淺，個(gè)別細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)綠色。

圖2 不同Triton X-100 透膜處理時(shí)間對(duì)洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞染色的影響

圖3 Triton X-100 透膜處理對(duì)人類口腔上皮細(xì)胞染色的影響

3 本實(shí)驗(yàn)其他問題的改進(jìn)方案

關(guān)于“觀察DNA 和RNA 在細(xì)胞中的分布”實(shí)驗(yàn)效果不理想的問題，已有多篇文獻(xiàn)有過報(bào)道。首先是針對(duì)染料中有深色顆粒影響鏡檢的問題，通過過濾的方法，可以有效去除染液中的雜質(zhì)，使鏡檢過程中出現(xiàn)的深色顆粒狀物質(zhì)消失［5］。 在實(shí)際應(yīng)用中筆者為提高過濾的效率和穩(wěn)定性， 采用了商品化的0.22 μm 濾器，使用60 mL 的一次性針管過濾，發(fā)現(xiàn)效果很好，效率很高，為一個(gè)班級(jí)過濾染液只需幾分鐘。

其次對(duì)于人類口腔上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)難度大、洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)容易的問題，經(jīng)過實(shí)踐發(fā)現(xiàn)確實(shí)如此，因此很多報(bào)道推薦用洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞完全取代口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。相比于人類口腔上皮細(xì)胞， 洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞的確有細(xì)胞體積大，低倍鏡即可清楚觀察、 取材容易、 步驟簡便、肉眼下即可找到等優(yōu)勢。但是如果只使用植物細(xì)胞觀察，放棄動(dòng)物細(xì)胞則未免有失偏頗，雖然教材沒有明確要求，但是作為統(tǒng)一的整體，動(dòng)物和植物都有代表，會(huì)使學(xué)生對(duì)于核酸功能的普適性認(rèn)識(shí)更加清楚，在教學(xué)中更有信服力。 由于取材都很容易，所以作者認(rèn)為動(dòng)、物植物細(xì)胞在本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該分組進(jìn)行，再全班討論，加強(qiáng)學(xué)生對(duì)不同實(shí)驗(yàn)材料區(qū)別和實(shí)驗(yàn)結(jié)果共性的認(rèn)識(shí)，從而達(dá)到更好的學(xué)習(xí)效果。

而對(duì)于人類口腔上皮細(xì)胞臨時(shí)裝片制作中酒精燈烤干過程中的問題， 有條件的學(xué)?？梢允褂?6～60℃烘箱烘干代替酒精燈烤干， 效果更佳，穩(wěn)定、可控。由于烤干的過程中火焰的大小、離火焰的距離和移動(dòng)玻片的頻率對(duì)于烤干的效果都有較大影響，整個(gè)班級(jí)在操作過程中難免會(huì)有小組因?yàn)檫@一步缺乏經(jīng)驗(yàn)導(dǎo)致的失誤而功虧一簣。而使用烘箱烘干5 min，可以得到大致相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 總結(jié)

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在“觀察DNA 和RNA 在細(xì)胞中的分布” 實(shí)驗(yàn)中， 使用0.1%～1%濃度的TritonX-100 代替8%鹽酸，透膜5 min，能起到增加細(xì)胞膜通透性、使染料著色更容易的效果，并且對(duì)于植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞都有較好的效果。

若不解離直接染色，亦能達(dá)到一定的效果，只是胞質(zhì)一般著色較淺。對(duì)于洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞樣本，染色前滴一小滴PBS 緩沖液可使樣本貼緊載玻片，不易折疊，便于染色；對(duì)于人類口腔上皮細(xì)胞，筆者認(rèn)為其他研究者所報(bào)道過的直接涂片的效果較好，省去了烘干或烤干的過程，如使用透膜劑或鹽酸解離，烘箱烘干的效果好于酒精燈烤干。

關(guān)于Triton X-100 的安全性問題， 其性質(zhì)穩(wěn)定，如接觸黏膜、皮膚后，有一定的刺激性，但在正常的較低濃度的使用環(huán)境中， 還沒有報(bào)道對(duì)人體健康有重大不良影響， 并且因其廣泛應(yīng)用于洗滌劑、個(gè)人護(hù)理用品、紡織加工等領(lǐng)域，可以成為中學(xué)教學(xué)中代替鹽酸的解離劑。如有條件，學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中佩戴一次性乳膠手套和口罩， 安全性有保障。