朱廣偉，鄭 煒，黃永建，華 進，楊樹鋼，葉建新

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科二區(qū) 福建醫(yī)科大學(xué)消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室，福建 福州 350005)

髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是Toll樣受體(Toll like receptors, TLRs)信號通路中的關(guān)鍵分子[1-2]。MyD88是Toll樣受體信號通路中重要的接頭蛋白，在TLRs信號通路中處于節(jié)點位置和關(guān)鍵點，調(diào)控信號通路下游因子的活化，從而啟動免疫反應(yīng)，且與多種疾病的發(fā)生有關(guān)聯(lián)[3-4]。研究[4-6]表明：MyD88不僅在免疫性疾病中具有重要作用，在炎癥性等疾病的發(fā)展中也具有重要作用。近年來研究[7-8]顯示：MyD88在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲中發(fā)揮重要的作用。但僅有少量報道關(guān)于MyD88在結(jié)直腸癌組織中的表達[9]。為了進一步探討MyD88與結(jié)直腸癌及其預(yù)后的關(guān)系，本研究通過檢測結(jié)直腸癌患者癌組織中MyD88的表達，分析其與患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系，以期為結(jié)直腸癌的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器 DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋公司，即用型UltraSensitive SP試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，MyD88抗體購于美國Affinity生物公司。隔水式恒溫烤箱GNP-9080購于上海精宏實驗設(shè)備有限公司，組織切片機AS325購于英國Shandon公司，光學(xué)顯微鏡DM4000B購于德國Leica公司。

1.2 臨床資料 選擇2010年3月—2011年3月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科接受手術(shù)治療并經(jīng)過病理證實的結(jié)直腸癌患者90例，年齡28～83歲，平均年齡(61.0±11.6)歲。本組研究對象均在入院時簽署知情同意書，知曉其腫瘤組織標(biāo)本和臨床病理資料用于科學(xué)研究。研究對象每隔3個月經(jīng)電話或者門診隨訪，本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 取術(shù)中切除的新鮮結(jié)直腸癌腫瘤組織標(biāo)本和癌遠(yuǎn)旁正常結(jié)直腸組織標(biāo)本(距離腫瘤大于8 cm)，經(jīng)甲醛固定，行常規(guī)石蠟包埋后備用。石蠟標(biāo)本行4 μm厚度連續(xù)切片，將石蠟切片脫蠟、水化，抗原修復(fù)暴露抗原決定簇，3%H2O2去離子水孵育25 min，PBS沖洗，去除PBS后，加入鼠抗人MyD88抗體50 μL后，4℃過夜；復(fù)溫后去除PBS，加入即用型UltraSensitive S-P試劑盒，PBS沖洗后加新鮮配置的DAB底物液，顯微鏡下觀察4～6 min，掌握染色時間，自來水沖洗。蘇木素復(fù)染1～3 min，自來水、雙蒸水洗5 min，PBS返藍(lán)5 min，脫水、透明、中性樹膠封片。

免疫組織化學(xué)的染色結(jié)果評估采用Image-Pro Plus 6.0軟件(美國Media Cybernetics公司)。每組隨機抽出15張切片，每片隨機選擇3個視野，每組共45個視野，使用軟件計算每個視野的平均吸光度(A)值，即積分A值(IA)/陽性面積，半定量MyD88的表達情況。

2 結(jié) 果

2.1 MyD88蛋白在結(jié)直腸癌患者癌組織和癌遠(yuǎn)旁組織中的表達水平 MyD88在結(jié)直腸癌患者癌遠(yuǎn)旁組織中的表達水平為0.165 4±0.142 6，明顯低于MyD88在結(jié)直腸癌組織中的表達水平(0.387 9±0.182 6，P<0.01)。見圖1(插頁五)。

2.2 不同臨床病理參數(shù)結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中MyD88的表達水平 結(jié)直腸癌組織中MyD88的表達水平與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤大小和組織學(xué)分化無關(guān)聯(lián)(P>0.05)。MyD88在結(jié)直腸癌組織中的表達水平：Ⅰ-Ⅱ期患者明顯低于Ⅲ-Ⅳ期患者(P<0.05)，T1-T2期患者明顯低于T3-T4期患者(P<0.05)，M0患者明顯低于M1患者(P<0.05)，無淋巴轉(zhuǎn)移患者明顯低于有淋巴轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)結(jié)直腸癌患者癌組織中MyD88蛋白表達水平

Tab.1 Expression levels of MyD88 in cancer tissue of colorectal cancer patients with different clinicopathological parameters

Clinicopathological parameternMyD88 expression t/FPAge (year) <60 ≥60 33570.254 7±0.069 8 0.295 7±0.102 9 0.1020.867Gender Male Female59310.321 9±0.087 1 0.369 7±0.161 1 0.8060.467Tumor size (cm) ≤3 >338520.354 2±0.124 5 0.372 6±0.098 6 1.0460.330Clinical stage Ⅰ-Ⅱ Ⅲ-Ⅳ21690.216 5±0.139 7 0.357 4±0.162 1 2.5410.003T stage T1-T2 T3-T430600.214 6±0.165 8 0.392 5±0.191 1 2.0750.039M stage M0 M18190.319 4±0.196 5 0.419 6±0.165 72.0730.041Lymph node metastasis No Yes43470.289 7±0.117 5 0.396 4±0.162 3 2.3860.023Histological differentiation Low 230.395 6±0.196 5 Mild 420.368 9±0.202 10.3770.095 High 250.312 0±0.189 5

2.3 MyD88表達水平與結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系 以90例患者結(jié)直腸癌組織MyD88表達水平均數(shù)(0.326 5)為準(zhǔn)，MyD88高表達組34例，低表達組56例。Kaplan-Meier法生存分析結(jié)果顯示：MyD88高表達組結(jié)直腸癌患者的生存率明顯低于低表達組(P<0.05)。見圖2。

*P<0.05 compared with low MyD88 group.

Fig.2 Survival curves of patients with colorectal cancer

3 討 論

MyD88基因主要在免疫細(xì)胞中表達，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞等。蛋白結(jié)構(gòu)研究顯示：MyD88的分子結(jié)構(gòu)包含C端Toll樣受體和白細(xì)胞介素1受體相關(guān)結(jié)構(gòu)域(TLR/IL-1R related domain,TIR)和N端結(jié)構(gòu)域，與死亡結(jié)構(gòu)域相似，可與其他具有死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用；另外，MyD88也存在中間結(jié)構(gòu)域，可與IL-1相關(guān)受體激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase, IRAK)相互作用，介導(dǎo)TLR信號的傳導(dǎo)，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄[10]。在哺乳動物的先天免疫中MyD88發(fā)揮重要的作用，是激活先天免疫反應(yīng)的基本因子[11]。

MyD88發(fā)揮功能調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控的重要因子是核因子κB(NF-κB)和活化蛋白1(AP-1)，其是重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，調(diào)控各種基因的轉(zhuǎn)錄表達從而發(fā)揮生物學(xué)功能，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素12(IL-12)和干擾素β(INF-β)等[12-13]。MyD88通過對多種信號通路的調(diào)控，在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮重要作用[14-15]。

MyD88在結(jié)直腸癌組織中的表達及與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，目前研究報道較少。杜永生[16]研究顯示：MyD88 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達水平降低，且與患者的性別、年齡、分化程度、腫瘤直徑、癌胚抗原(CEA)、有無淋巴轉(zhuǎn)移、浸潤程度、分布部位和Duke’s分期無關(guān)。秦艷等[17]研究顯示：MyD88在結(jié)直腸癌組織中的表達水平升高，且組織異型性越大，表達水平越高，MyD88在正常黏膜、增生性息肉、腺瘤和腺癌組織中的表達水平逐漸升高。于月紅等[18]研究顯示：結(jié)直腸癌組織中MyD88 mRNA表達水平明顯升高，低分化癌組織中MyD88 mRNA表達水平最高，臨床分期越晚MyD88 mRNA表達水平越高。另外，Wang 等[9]發(fā)現(xiàn)：MyD88在結(jié)直腸癌組織中呈高表達，且肝轉(zhuǎn)移患者MyD88表達水平更高；MyD88高表達的結(jié)直腸癌患者預(yù)后差，是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素。由此可見，到目前為止MyD88在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義尚無定論，需要進一步的研究。

本研究結(jié)果顯示：MyD88在結(jié)直腸癌患者癌遠(yuǎn)旁組織中的表達水平明顯低于結(jié)直腸癌組織，表明MyD88在結(jié)直腸癌組織中的表達水平增加。杜永生等[16]發(fā)現(xiàn)：結(jié)直腸癌組織中MyD88 mRNA表達水平降低，且與患者各臨床病理因素?zé)o關(guān)。另外，于月紅等[18]報道：結(jié)直腸癌患者癌組織中的mRNA表達水平明顯升高，低分化癌組織中MyD88 mRNA表達水平最高，且臨床分期越晚，MyD88 mRNA表達水平越高。這種完全不一致的報道，可能是因為mRNA檢測的誤差，也可能是因為樣本量的問題；另外，mRNA的檢測不能反映MyD88蛋白在結(jié)直腸癌組織的表達情況，免疫組織化學(xué)檢測蛋白表達水平具有更好的優(yōu)勢，因為mRNA表達水平高，不一定蛋白的表達水平高。

秦艷等[17]雖然檢測了MyD88在結(jié)直腸癌組織中表達的情況，也揭示出從腺瘤到癌組織中MyD88 表達的明顯差異，但是并未分析MyD88在結(jié)直腸癌中的表達與患者預(yù)后的關(guān)系。本研究顯示：MyD88 高表達的結(jié)直腸癌患者生存率明顯降低；且臨床病理參數(shù)分析顯示：MyD88的表達水平與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤大小和組織學(xué)分化無關(guān)，與患者的臨床分期、T分期、M分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有關(guān)，提示MyD88高表達水平促進了結(jié)直腸癌的進展。

關(guān)于MyD88在結(jié)直腸癌中的作用，本課題組正在進行下一步研究，如MyD88和腫瘤化療耐藥性的問題。另外，本課題組將進一步研究MyD88在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用，為結(jié)直腸癌的臨床治療提供理論依據(jù)。