李 俠，杜世杰，戎婷婷，白 靜，韓志平

（1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100193；3.山西大同市城區(qū)投資促進(jìn)局，山西 大同 037009）

叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是土壤中廣泛存在的一類重要微生物，能與陸地約80%的植物共生，促進(jìn)植物吸收養(yǎng)分尤其是磷，增強(qiáng)植物抗逆性并改善土壤結(jié)構(gòu)，影響植物群落結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)力［1-5］。然而，由于AM真菌是嚴(yán)格的專性共生生物，脫離了宿主植物即無法正常生長發(fā)育和完成其生命過程。雖然研究者試圖探明宿主植物與菌根真菌間的信息和物質(zhì)交換過程，但至今仍無法建立AM真菌的離體培養(yǎng)，成為相關(guān)研究以及叢枝菌根廣泛應(yīng)用的主要障礙。目前AM真菌培養(yǎng)均在共生條件下進(jìn)行，通常采用的基質(zhì)為土壤，但從土壤中去除孢子表面的污染十分困難，同時也難以獲得足夠量的純凈菌絲體［6］。胡蘿卜根系質(zhì)粒離體培養(yǎng)菌絲法（Ri T-DNA transformed carrot roots）雖然可以得到純凈的菌絲體和孢子，但這種培養(yǎng)體系的建立十分繁瑣，而且難于操作。玻璃珠分室培養(yǎng)將AM真菌的傳統(tǒng)基質(zhì)培養(yǎng)與無土培養(yǎng)結(jié)合起來，利用這種培養(yǎng)技術(shù)可以培養(yǎng)出純凈的AM真菌［7］，但由于玻璃珠粒徑大，作為基質(zhì)空隙大，持水性差，水分難以控制，因而菌絲量較少，且重復(fù)間變異很大，所以迫切需要尋求一種能進(jìn)行粗放管理而且菌絲生物量高的培養(yǎng)方法。我們借鑒了INVAM（http：//invam.wvu.edu）中采用的沙培收集菌絲的方法，將玻璃珠（2 mm）與沙子（0.25～1.00 mm）混合，彌補(bǔ)了單純使用玻璃珠所造成的不足，管理要求比較低，且又能較容易分離到純凈的菌絲體。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

宿主植物采用玉米（Zea mays L.）。菌劑采用Glomus mosseae （Nicol.&Gerd.） Gerdemann&Trappe（BEG167） 和Glomus intraradices Schenck&Smith（BEG141）。根室基質(zhì)為珍珠巖，菌絲室基質(zhì)為玻璃珠（2 mm）或沙子（0.25～1.00 mm）。珍珠巖、玻璃珠和沙子均經(jīng)高溫滅菌（100℃，2 h）處理。

1.2 試驗裝置

培養(yǎng)裝置為兩室培養(yǎng)，即在大的試驗盆中放置小尼龍網(wǎng)袋。大盆作為根室，用于植物生長，體積為1 L。尼龍網(wǎng)袋則作為菌絲室，由30 μm尼龍網(wǎng)進(jìn)行縫織而成，其作用是允許根外菌絲穿過，而根系不能進(jìn)入尼龍網(wǎng)中，體積為250 mL（圖1）。

圖1 試驗用盆

1.3 試驗設(shè)計

根室基質(zhì)采用珍珠巖。菌絲室設(shè)2種不同基質(zhì)處理，分別為玻璃珠、玻璃珠和沙子混合（以體積1∶1混合）。分別接種叢枝菌根真菌Glomus mosseae和Glomus intraradices，以不接種（-M）為對照，共6個處理，隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)4次。根室裝滅菌珍珠巖35 g，與70 g滅菌（接種處理）或未滅菌（不接菌的對照處理）菌劑混勻后裝入。菌絲室裝250 g滅菌玻璃珠或玻璃珠和沙子的混合物。培養(yǎng)時間為2005年5月31日至2006年7月31日。播種7 d后間苗，每盆保留3株生長一致的幼苗。試驗在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物營養(yǎng)培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，生物鏑燈補(bǔ)充光照。光照強(qiáng)度為250 μmol/（m2·s），室內(nèi)溫度保持在18～22℃。利用稱重法監(jiān)控水分并及時補(bǔ)充半強(qiáng)度LANS營養(yǎng)液（發(fā)芽后前3 d供應(yīng)1/10的稀釋營養(yǎng)液，以促進(jìn)孢子萌發(fā)）［8］，基質(zhì)水分控制在 12%～20%（V/V）。

1.4 指標(biāo)測定

采用曲利苯藍(lán)染色法測定根系侵染率［9］。將培養(yǎng)基質(zhì)與水混合攪拌后搜集菌絲，烘干后稱干重。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗所得到的數(shù)據(jù)均由SAS軟件包內(nèi)的單因素和兩因素方差分析和Duncan多重比較進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植株根系侵染率

未接種植株根系均未觀察到菌根真菌侵染，說明試驗操作符合要求，2種菌根真菌均與玉米根系形成良好的菌根，且接種2種真菌的植株根系侵染率差異達(dá)到顯著水平，接種G.intraradices植株根系侵染率顯著高于接種G.mosseae植株，其根系侵染率分別為88.3%和58.5%。菌絲室不同基質(zhì)處理對植株根系侵染率無顯著影響（表1）。

2.2 植株生長狀況

接種菌根真菌（G.intraradics）植株地上部干重、根系干重和總干重顯著高于對照植株，而接種菌根真菌植株冠根比卻顯著低于對照植株。菌絲室不同基質(zhì)處理對植株地上部干重、根系干重和總干重均無顯著影響（表1）。

表1 接種和基質(zhì)處理對玉米植株菌根侵染率、植株地上部干重、根系干重、總干重和冠根比的影響①

2.3 AMF根外菌絲生物量

從對照菌絲室收集到一定量的菌絲，說明培養(yǎng)過程中基質(zhì)中有雜菌菌絲。接種菌根真菌顯著增加了AMF根外菌絲的干重，其中接種G.mosseae處理的根外菌絲干重顯著高于對照處理和接種G.intraradics處理；菌絲室不同基質(zhì)處理對根外菌絲干重的影響僅在接種G.mosseae時差異達(dá)到顯著水平，表現(xiàn)為玻璃珠和沙子混合基質(zhì)處理根外菌絲干重顯著高于玻璃珠基質(zhì)處理，前者約為后者的4.7倍。接種G.intraradics時，2種基質(zhì)處理對菌絲干重?zé)o顯著影響（圖2）。

圖2 接種和基質(zhì)處理對菌絲室菌絲干物重的影響

3 結(jié)論與討論

比較分析表明，接種G.mosseae的植株根系侵染率顯著低于G.intraradics處理，而G.mosseae根外菌絲量卻顯著高于G.intraradics。很多研究表明G.mosseae的菌絲體比較發(fā)達(dá)，而孢子數(shù)量少；G.intraradics根內(nèi)孢子比較多，根外菌絲較少。

Chen等［7］用玻璃珠收集菌絲試驗中，收集到的Glomus versiforme孢子和菌絲體量可達(dá)20 mg，G.mosseae可達(dá)10 mg，其菌絲室裝入玻璃珠量為960 g，因而單位基質(zhì)收集到G.mosseae的菌絲干重為10.04 mg/kg。本試驗中菌絲室裝入玻璃珠與沙子混合物250 g，收集到G.mosseae的菌絲干重為6.1 mg，即單位基質(zhì)收集到G.mosseae菌絲干重為24.4 mg/kg，約為Chen等［7］采用玻璃珠收集菌絲干重的2.4倍。

在本試驗中，除在菌絲室采用玻璃珠和沙子混合基質(zhì)處理時G.mosseae菌絲干重比較高外，其余處理菌絲干重均較低，接近于背景值。可能的原因是植株生長過程中營養(yǎng)液供應(yīng)濃度較低，管理較粗放。初步研究顯示，利用玻璃珠和沙子混合作為基質(zhì)培養(yǎng)菌根真菌可以方便管理，如何提高多種菌根真菌的菌絲量仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，接種菌根真菌顯著增加了植株生物量。接種菌根真菌G.mosseae的侵染率顯著低于真菌G.intraradics，但根外菌絲量卻反之。相比單用玻璃珠，采用玻璃珠和沙子混合作為基質(zhì)可以收集到較多的G.mosseae根外菌絲。