汪華君， 蔣俊， 尹江寧

(1. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001； 2. 江蘇大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 3. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

糖尿病是由于胰島素分泌絕對或相對不足，糖代謝紊亂而引起的以高血糖為主要特征的內(nèi)分泌代謝疾病，是世界三大慢性病之一[1]。糖尿病腎病是由高血糖引起的以微血管損害為主的腎小球病變，是糖尿病的主要致死、致殘性微血管并發(fā)癥之一[2]，有30%～45%的患者最終導(dǎo)致終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)[3]。明代醫(yī)家所著《醫(yī)便》中記載“二至丸清上補(bǔ)下第一方，價廉而功極大”，是治療肝腎陰虛的要藥，由墨旱蓮和女貞子兩味藥(1 ∶1)組成。近年來，研究表明二至方具有降血糖的功效[4]。殷越等[5]在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，二至方對于D-半乳糖致衰老大鼠的血糖血脂異?？梢园l(fā)揮較好的作用，且在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。大量研究證實(shí)，血脂血糖異常與糖尿病腎病的發(fā)生、腎功能下降以及ESRD的發(fā)生相關(guān)[6-7]，而糖尿病腎病患者的腎功能下降、蛋白尿增加反過來又會加劇血脂血糖代謝的異常[8-9]。若將二至方應(yīng)用于降糖方案中，不僅可以調(diào)節(jié)血糖血脂，而且可以一定程度上改善腎功能，防治糖尿病腎病。二至方中含有豐富的活性三萜類化合物，如齊墩果酸、乙酰齊墩果酸、熊果酸等[10-13]。但是，針對二至方中三萜類成分的藥代動力學(xué)尚不清楚。本研究首次建立了測定二至方中代表性三萜類成分含量的方法，并探討其在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 墨旱蓮、女貞子藥材購自鎮(zhèn)江存仁堂醫(yī)藥連鎖有限公司；二至方是按照墨旱蓮 ∶女貞子1 ∶1的比例自制；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；水為超純水，其他試劑均為分析純。齊墩果酸和熊果酸購自西安開來生物科技有限公司(純度>98.5%)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 雌性SD大鼠6只，體重(220±20)g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證為SYXK(蘇)20130036。

1.1.3 儀器 Agilent 1260 HPLC，脫氣裝置、G4212A型1290檢測器和Chemstation工作站，KQ-250D型醫(yī)用數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BP211D電子天平(德國賽多利斯公司)；渦旋振蕩儀(Vortex-2，美國Scientific Industries公司)；Anke離心機(jī)TGL-16G(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.1%甲酸水(90 ∶10，V/V)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2 對照品溶液的配制 稱取齊墩果酸和熊果酸各10 mg，精密稱定，甲醇溶解、超聲助溶后定容至50 mL，即得 2種待測化合物的對照品儲備溶液；再將齊墩果酸和熊果酸對照品儲備溶液稀釋至0.5、1.0、10.0、20.0、40.0和50.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液。

1.2.3 二至方提取物、大鼠血漿及組織樣品的采集與處理 分別稱取7個不同批次的二至方樣品20 mg，置于25 mL錐形瓶中，加入甲醇10 mL，超聲提取40 min，放冷，補(bǔ)充重量，過0.45 μm的微孔濾膜，供含量測定用。二至方提取物采用10倍量80%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并兩次提取液，真空干燥，得干燥粉末，備用。

3只SD大鼠正常飼養(yǎng)，給藥前12 h禁食不禁水。按照3 g/kg的劑量給予二至方提取物，提取物用0.5%羧甲基纖維素鈉制成混懸液灌服，于給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h于眼眶后靜脈叢取血0.5 mL，置肝素化的離心管中；另取3只大鼠，在灌胃2 h后，脫頸處死，立即取心、肝、脾、肺和腎組織，并用生理鹽水洗凈組織浮血，濾紙吸干，稱取各組織，加入生理鹽水勻漿，制成1.0 g/mL組織勻漿液；取各組織勻漿液和血液樣品各 200 μL，分別加入400 μL乙腈，渦流振蕩混合，5 000 r/min離心10 min，取上清液，N2吹干。殘?jiān)芯芗尤?00 μL甲醇，渦流振蕩2 min，靜置，10 000 r/min離10 min，取上清液作為供試品溶液，過0.22 μm濾膜，待HPLC測定。

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 取大鼠空白血漿0.1 mL，精密加入10 μL方法“1.2.2”中所配置的不同濃度的混合對照品溶液，按血漿樣品的處理方法操作，并進(jìn)行色譜分析，以峰面積Y對血藥濃度X(μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得齊墩果酸和熊果酸的回歸方程分別為Y=6.510 975 36X+2.180 605 9 (R2=0.999 78)、Y=5.412 280 24X-1.627 312 6(R2=0.999 18)，結(jié)果表明齊墩果酸和熊果酸在0.5～50.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。齊墩果酸和熊果酸的定量下限(LOD)分別為 1.24、1.26 μg/mL。代表性的HPLC圖譜如圖1所示。

1.2.4.2 穩(wěn)定性和回收率 對于二至方提取物，同一供試品，按供試品溶液的制備方法操作，分別于0、1、2、4、8 h精密吸取方法“1.2.2”中對照品溶液，進(jìn)樣，齊墩果酸和熊果酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.15%和1.34%，表明供試品溶液穩(wěn)定性較好；另外，取已知含量的供試品3份，分別按照0.5倍加標(biāo)量精密加入齊墩果酸和熊果酸對照品溶液，按照供試品溶液的制備方法處理，測定并計(jì)算回收率，結(jié)果齊墩果酸和熊果酸的回收率分別為99.8%和102.1%，表明回收率良好。

對于血漿樣品，按照“1.2.4.1”項(xiàng)下制備齊墩果酸和熊果酸血漿樣本，并按同樣方法處理，測得樣品峰面積分別為A，另取甲醇0.1 mL，加入10 μL一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其與質(zhì)控樣品相同，按血漿樣品的處理項(xiàng)下操作，進(jìn)樣測得樣品峰面積分別為B，求得血漿中齊墩果酸和熊果酸的提取回收率(A/B)。結(jié)果齊墩果酸的提取回收率為82.15%，熊果酸的提取回收率為 83.73%，表明兩者的回收率良好。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)所測得齊墩果酸和熊果酸的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，利用DAS 2.0程序分別計(jì)算各自主要的藥動學(xué)參數(shù)，并繪制血藥濃度-時間曲線。

A： 齊墩果酸和熊果酸混合對照品；B： 二至方提取物；C： 大鼠灌胃給藥二至方提取物后血漿及組織；D： 空白血漿；E： 組織樣品的陰性對照。1. 齊墩果酸；2. 熊果酸

圖1二至方提取物、大鼠血漿及組織中齊墩果酸和熊果酸的HPLC圖譜

2 結(jié)果

2.1 二至方中齊墩果酸和熊果酸的含量

測定了7個批次的二至方中齊墩果酸和熊果酸的含量，結(jié)果表明齊墩果酸的含量范圍在0.67%～4.26%，熊果酸的含量范圍在0.21%～1.19%。齊墩果酸和熊果酸均為三萜類成分，且是同分異構(gòu)體，但是兩者含量間的差異較大，齊墩果酸的含量相對較熊果酸高。各批次的含量檢測結(jié)果見表1。

表1 齊墩果酸和熊果酸在二至方中的分布 n=3， %

2.2 齊墩果酸和熊果酸在組織中的分布

結(jié)果表明，大鼠灌胃二至方提取物后，肝、心、脾、肺和腎組織中齊墩果酸的濃度分別為197.60、11.70、1.10、43.70和40.10 mg/L，在肝臟中含量最高；熊果酸的濃度分別為92.90、61.80、37.90、307.50和301.30 mg/L，在肺和腎臟中含量較高。

2.3 齊墩果酸和熊果酸在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征

測定結(jié)果顯示，齊墩果酸和熊果酸的達(dá)峰時間(Tmax)均為0.5 h，表明其達(dá)峰時間相似；齊墩果酸和熊果酸的峰濃度(Cmax)分別為(111.33±10.50) mg/L、(153.72±3.35) mg/L；此外，齊墩果酸和熊果酸的藥時曲線下面積[AUC(0-∞)]分別為(342.44±10.15) mg/(L·h)、(589.79±9.49) mg/(L·h)；齊墩果酸和熊果酸的半衰期(t1/2z)分別為 (2.93±0.03) h、(3.19±0.02) h，表明齊墩果酸的體內(nèi)消除較熊果酸略快。見圖2和表2。

圖2 大鼠灌服二至方提取物后齊墩果酸和熊果酸的體內(nèi)藥物-時間曲線 (n=3)

3 討論

本研究最初選用HPLC-MS/MS配備電噴霧離子源建立同時測定齊墩果酸和熊果酸的方法，但是此2個目標(biāo)成分是同分異構(gòu)體，HPLC-MS/MS所用的色譜柱為150 mm，兩者保留時間、離子碎片和相對豐度比均完全相同，因此難以實(shí)現(xiàn)兩者的分離。隨后，選用HPLC連接250 mm長柱子，并調(diào)節(jié)流動相比例，最終實(shí)現(xiàn)了齊墩果酸和熊果酸的基線分離并滿足中藥飲片及生物樣品的定量要求。

表2 灌胃二至方提取物后大鼠血漿中齊墩果酸和熊果酸的藥動學(xué)參數(shù) n=3

AUC: 曲線下面積；AUMC: 一階矩曲線下面積；VRT: 滯留時間方差；MRT: 平均駐留時間

女貞子和墨旱蓮2味中藥飲片中雖均含有一定量的齊墩果酸和熊果酸，但其主要來源是女貞子[14-17]。由藥動學(xué)參數(shù)可知，齊墩果酸和熊果酸均能在胃腸道被吸收入血，由于齊墩果酸和熊果酸為同分異構(gòu)體，且結(jié)構(gòu)極其相似，兩個甲基都在20位的為齊墩果酸，而兩個甲基分別在19、20位是熊果酸，因此其藥動學(xué)參數(shù)也具有一定的相似性。

二至方能夠發(fā)揮抗糖尿病腎病作用，與其中所含有效成分能否被吸收分布至靶器官(即腎臟組織)以及有效成分在靶器官中的濃度直接相關(guān)。根據(jù)組織分布的結(jié)果，在大鼠腎臟組織中能檢出大量的齊墩果酸和熊果酸，其中熊果酸的含量較齊墩果酸更高。研究表明，齊墩果酸能通過降低2型糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善糖尿病腎病、保護(hù)腎微結(jié)構(gòu)[18-21]。熊果酸能降低血糖、抗氧化和抑制炎癥反應(yīng)從而保護(hù)糖尿病所致腎損傷，并能抑制糖尿病腎病的早期損傷[22-24]。因此，齊墩果酸和熊果酸可能是二至方抗糖尿病腎病的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，后續(xù)工作將進(jìn)一步探討齊墩果酸和熊果酸通過保護(hù)腎臟中足細(xì)胞從而抗糖尿病腎病的機(jī)制。