楊媚 羅威 馬曉麗

【摘 要】目的：分析維吾爾族局部晚期或晚期食管癌患者的血清差異蛋白相關(guān)通路。方法：收集維吾爾族食管鱗癌患者28例，采集維吾爾族食管癌患者接受放化療前后的靜脈血，對(duì)食管癌與健康對(duì)照組進(jìn)行差異蛋白篩選并導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行進(jìn)一步分析。結(jié)果：放化療后近期療效無(wú)效組與近期療效有效組比對(duì)，共篩選出52個(gè)差異蛋白；放化療后PFS大于1年組與小于1年組比對(duì)，共篩選出128個(gè)差異蛋白；近期療效行KEGG通路分析中，共篩選出4個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異通路；遠(yuǎn)期療效PFS大于1年組與PFS小于1年組比對(duì)差異蛋白導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的KEGG通路有1個(gè)。結(jié)論：在KEGG通路分析中，維吾爾族食管癌患者在治療前后均觀(guān)察到，KEGG通路TLR、NF-kB信號(hào)通路有相似的差異蛋白參與，均提示預(yù)后不良，可以作為今后研究重點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】食管癌；民族；蛋白；信號(hào)通路

【中圖分類(lèi)號(hào)】R735.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-6851（2018）08--01

新疆部分高發(fā)腫瘤疾病呈現(xiàn)地域性分布，如南疆范圍內(nèi)以宮頸癌為主，北疆范圍內(nèi)以食管癌為主。維吾爾族是新疆主要的少數(shù)名族，人口約占全區(qū)的一半以上。且王振家等[1]報(bào)道在哈密地區(qū)維吾爾族惡性腫瘤分布中，食管癌排在了第1位，而且維吾爾族惡性腫瘤的總發(fā)病率高于漢族、哈薩克族。在人體血液循環(huán)中有大量的小分子量（low molecular weight，LMW）蛋白。這些小分子量蛋白蘊(yùn)含的信息能用于早期診斷、鑒別診斷、療效評(píng)估和預(yù)后判斷[2]。腫瘤患者的體液中如血清或血漿就是可靠的標(biāo)記物來(lái)源[3]。理想的蛋白標(biāo)記物應(yīng)具有很高的特異性和敏感性，所應(yīng)用的技術(shù)可靠、快速和經(jīng)濟(jì)；標(biāo)本中含有的標(biāo)記物容易獲得。因此，我們將對(duì)維吾爾族局部晚期食管癌患者的療效相關(guān)的血清差異蛋白進(jìn)行篩選并進(jìn)一步行KEGG通路分析，試圖發(fā)現(xiàn)具有預(yù)測(cè)放化療療效價(jià)值的分子標(biāo)記物。

1 材料與方法

1.1 材料收集

收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2014年06月-2015年06月收治的臨床分期為III-IVA期的維吾爾族食管鱗癌患者28例。采集接受放化療前食管鱗癌患者外周靜脈血5ml，所有食管癌患者完成同期放化療后，按照隨訪(fǎng)時(shí)間長(zhǎng)短再次采集靜脈血5ml。所有病例均經(jīng)胃鏡活檢，組織病理確診為鱗狀細(xì)胞癌，分期為III-IVA期食管癌患者，一般狀況（PS）評(píng)分≤2分。所有患者預(yù)計(jì)生存期≥6個(gè)月，無(wú)主要器官功能障礙，心、肺、肝、腎功能基本正常。

同期放化療方案：化療方案：FP方案：5-FU （氟尿嘧啶）（750-1000mg/m2）+DDP（順鉑）（75-100mg/m2），3-4周一次。所有的患者先行同步放化療，放療結(jié)束后然再序貫化療，直至完成共4-6周期化療。如近期療效評(píng)價(jià)為有效，繼續(xù)原化療方案。如評(píng)價(jià)為無(wú)效，則改用TP方案：紫杉醇（135-150mg /m2） /多西他賽（75mg/m2） +卡鉑（AUC5-6） /順鉑（75mg/m2）。放療方案：三維適形放療或調(diào)強(qiáng)放療，DT50-60Gy/2Gy /25-30f。

1.2 方法

采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)（iTRAQ），該技術(shù)通過(guò)蛋白質(zhì)提取、消化，利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽，然后用高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，篩選綜合治療前后食管癌患者血清蛋白質(zhì)譜表達(dá)差異。將差異蛋白導(dǎo)入KEGG的Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)，分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)的相關(guān)的代謝通路。

1.3 血清差異蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)

按對(duì)比要求進(jìn)行組間比較，組間比值大于1.2（表達(dá)上調(diào)）或小于0.833（表達(dá)下調(diào)），P<0.05為差異蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)。其中組間比值大于1.5為顯著表達(dá)上調(diào)，組間比值小于0.6為顯著表達(dá)下調(diào)，對(duì)篩選的差異蛋白進(jìn)一步在http：//www.uniprot.org進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 放化療后食管癌患者近期療效差異蛋白篩選

對(duì)完成放化療后的患者進(jìn)行隨訪(fǎng)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示：近期療效有效的食管癌患者有15人，其中完全緩解的有1人，部分緩解的有14人；近期療效無(wú)效的食管癌患者有13人，其中穩(wěn)定的有8人，進(jìn)展的有5人，客觀(guān)有效率為53.6%。共篩選出52個(gè)差異蛋白，上調(diào)蛋白有29個(gè)，下調(diào)蛋白有23個(gè)，其中顯著表達(dá)上調(diào)的蛋白有角蛋白10（K10）、角蛋白2（K2）等，顯著表達(dá)下調(diào)的蛋白有組蛋白H4（H4）、組蛋白H2B等。

2.2 放化療后食管癌患者PFS大于1年與小于1年差異蛋白篩選

PFS大于1年組的食管癌患者有16人，PFS小于1年組的食管癌患者有12人，其中有5人在1年內(nèi)死亡，7人在1年內(nèi)進(jìn)展。共篩選出128個(gè)差異蛋白，上調(diào)蛋白有73個(gè)，下調(diào)蛋白有55個(gè)。其中顯著表達(dá)上調(diào)的蛋白有cDNA FLJ93312（B2R773）、REV25-2（A0N7J6）等，顯著表達(dá)下調(diào)的蛋白有免疫球蛋白重鏈可變區(qū)1-18（IGHV1-18）等

2.3 近期療效血清差異蛋白相關(guān)通路分析

52個(gè)局部晚期或晚期維吾爾族食管鱗癌放化療后近期療效組的差異蛋白被導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)后，將不同的蛋白質(zhì)富集到共同代謝途徑中，共得到104個(gè)差異蛋白的KEGG通路，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的KEGG通路有4個(gè)（P<0.05），沒(méi)有與腫瘤有相關(guān)性的通路（表1）。

2.4 局部晚期或晚期維吾爾族食管鱗癌患者PFS大于1年組與PFS小于1年組比對(duì)差異血清蛋白相關(guān)通路分析

128個(gè)局部晚期或晚期維吾爾族食管鱗癌放化療后遠(yuǎn)期療效PFS大于1年組與PFS小于1年組比對(duì)差異蛋白被導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)后，將不同的蛋白質(zhì)富集到共同代謝途徑中，共得到127個(gè)差異蛋白的KEGG通路，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的KEGG通路有1個(gè)（P<0.05），與腫瘤有相關(guān)性的通路有1個(gè)（表2）。

3 討論

由于食管癌缺乏特異性的分子通路機(jī)制的結(jié)果，使得個(gè)體化治療仍處于盲區(qū)。若能在治療前根據(jù)食管癌患者分子蛋白情況，預(yù)知化療方案的敏感度，精準(zhǔn)制定符合患者個(gè)體差異的有效方案，就可使患者獲得收益大而毒副作用小的的效果。本研究通過(guò)采用iTRAQ最新蛋白定量技術(shù)，收集了維吾爾族食管鱗癌患者28例，通過(guò)治療后近期療效好壞、PFS生存時(shí)間長(zhǎng)短進(jìn)行分組對(duì)比，并將顯著差異蛋白導(dǎo)入KRGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路分析，試述如下：

局部晚期或晚期維吾爾族食管鱗癌近期療效行KEGG通路分析中，將52個(gè)差異蛋白導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到104個(gè)差異蛋白的KEGG通路，我們選擇P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的信號(hào)通路，共篩選出4個(gè)，卻無(wú)腫瘤相關(guān)通路。發(fā)現(xiàn)近期療效中組蛋白H2B下調(diào)參與TLR通路（P=0.28），而該通路的激活直接影響腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，這與近期療效無(wú)效提供一個(gè)很好的解釋?zhuān)M(jìn)一步驗(yàn)證了此通路有促進(jìn)癌癥發(fā)展的結(jié)論，可作為今后研究的重點(diǎn)。

我們同樣將128個(gè)遠(yuǎn)期療效PFS大于1年組與PFS小于1年組比對(duì)差異蛋白導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，將不同的蛋白質(zhì)富集到共同代謝途徑中，共得到127個(gè)差異蛋白的KEGG通路，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的KEGG通路有1個(gè)（P<0.05），PPAR信號(hào)通路為腫瘤相關(guān)通路。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活型受體（peroxisome proliferator activated-receptors，PPARs）是一類(lèi)由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于受體超家族成員。曾有學(xué)者[4]已經(jīng)證實(shí)胰腺癌中PPARα水平明顯高于腫瘤臨近組織，PPARα表達(dá)水平與腫瘤患者高的生存率呈負(fù)相關(guān)。而Wu K[5]在食管癌方面的研究中發(fā)現(xiàn)，PPARg的激活抑制了tlr4依賴(lài)性MAPK通路，抑制了食管癌細(xì)胞的增殖并且誘導(dǎo)食管癌腫瘤細(xì)胞凋亡，本部分研究中PFS>1年組與PFS<1年組的差異蛋白載脂蛋白（a、A-II、A-I、C-III、A-IV）、cDNA，F(xiàn)LJ93312參與該通路的調(diào)控，與Wu K既往研究一致，促進(jìn)了食管癌的凋亡，有較好的預(yù)后。雖然在治療前后均有此通路參與，但P>0.05，考慮經(jīng)過(guò)一段時(shí)間放化療，PPAR信號(hào)通路進(jìn)一步激活起到抑制腫瘤作用，使患者獲得比較長(zhǎng)的生存時(shí)間。

除此之外，信號(hào)通路NF-kB在此療效對(duì)比中同樣有差異蛋白脂多糖、cDNA FLJ75416參與，活化的NF-kB轉(zhuǎn)位到核內(nèi)與其相關(guān)的DNA基序結(jié)合可以誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄。包括多種病原的組分例如脂多糖，前炎性細(xì)胞因子等在內(nèi)的多種信號(hào)可活化這種途徑。脂多糖與腫瘤促進(jìn)有一定相關(guān)，此蛋白下調(diào)是否可下調(diào)NF-kB通路的表達(dá)，使患者有較好的預(yù)后，我們需要進(jìn)一步沉默或激活靶基因進(jìn)行證實(shí)。

通過(guò)KEGG通路分析差異蛋白參與的信號(hào)通路，進(jìn)一步驗(yàn)證了差異表達(dá)的血清蛋白的功能，為今后差異蛋白的靶基因的研究奠定了基礎(chǔ)。由于食管癌分子蛋白可以參加數(shù)百種通路，且通路之間影響也有相互交叉，且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的通路也并非真正意義上無(wú)效果的通路，故特異性通路需要更多的有質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)來(lái)探索及驗(yàn)證。

總而言之，此部分內(nèi)容分別分析了維吾爾族近期療效、遠(yuǎn)期療效相關(guān)的差異顯著蛋白相關(guān)的信號(hào)通路。在KEGG通路分析中，維吾爾族食管癌患者在治療前后均觀(guān)察到，KEGG通路TLR、NF-kB信號(hào)通路有相似的差異蛋白參與，均提示預(yù)后不良，可以作為今后研究重點(diǎn)。

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