周開茹，龔劍，熊小萍，許素嘩，唐煥文*，劉小山*

1. 廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院/東莞市環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 東莞 523808；2. 廣州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006

內(nèi)分泌干擾物（Endocrine disrupting chemicals，EDCs）是對保持動態(tài)平衡的生物體內(nèi)天然激素起干擾作用的外源物質(zhì)，可通過核受體或內(nèi)分泌激素的合成、分泌、傳遞和清除兩種途徑影響生物的發(fā)育、繁殖和行為，其作為一類新型的環(huán)境污染物逐漸引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注（Kang et al.，2014）。大量數(shù)據(jù)表明，世界各大水體均受到不同程度的EDCs污染，EDCs在極低濃度下就可引起水生生物的生殖發(fā)育障礙（Hampl et al.，2016）。EDCs蓄積于水生生物體內(nèi)，可通過食物鏈或飲用水等被人體吸收進(jìn)而影響人體健康。人群流行病學(xué)研究顯示，EDCs可使女性不孕、胎兒早產(chǎn)、早期卵巢功能衰退、激素水平異常；使男性前列腺癌發(fā)病率增加，精子量減少（Costa et al.，2014；Patel et al.，2015；Sweeney et al.，2015）?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示，污水處理廠中的污水是水體中EDCs的主要來源（Wang et al.，2016）。現(xiàn)有的污水處理工藝主要采用生物降解法，包括活性污泥法、厭氧/缺氧/好氧法（Anaerobic/Anoxic/Oxic，A/A/O）法、氧化溝法（Oxidation ditch，OD）法、膜生物反應(yīng)器法等，這些處理工藝主要針對有機(jī)污染物、氮磷的去除，對微污染物如 EDCs的處理效果未知。研究顯示，城市污水中 EDCs的處理效果受多種因素影響，如處理的工藝類型及操作的條件等（聶亞峰等，2011）。

化學(xué)分析法常被用于EDCs的測定，但應(yīng)用此方法大規(guī)模檢測環(huán)境樣品時(shí)，往往費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且此方法僅限于對已知目標(biāo)物的分析，不能反映多種化合物可能產(chǎn)生的累加、協(xié)同等生物效應(yīng)。目前已建立多種生物測試方法用于檢測城市污水處理廠出廠水中的內(nèi)分泌干擾活性，主要生物測試法有細(xì)胞增殖法、報(bào)告基因法、酶聯(lián)免疫吸附法和重組酵母法等（馬軍等，2009），這些方法主要是用來檢測與雌激素受體結(jié)合啟動雌激素應(yīng)答元件而產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的環(huán)境雌激素類化合物。MVLN細(xì)胞試驗(yàn)法就是一種報(bào)告基因法，是在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7雌激素應(yīng)答原件上游插入了熒光素酶報(bào)告基因，能夠通過熒光量強(qiáng)度檢測化合物的雌激素受體結(jié)合活性（Pons et al.，2009）。事實(shí)上，許多EDCs是通過非受體介導(dǎo)的途徑干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)，如干擾內(nèi)分泌激素的合成、激活、轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝等。研究發(fā)現(xiàn)，來源于人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞NCI-H295R保留了類固醇激素合成途徑，可以從激素水平、酶的活性及基因表達(dá)水平研究外源化合物類固醇激素的干擾效應(yīng)（Wang et al.，2015）。USEPA已經(jīng)將H295R作為EDCs第一階段篩查的工具。前期研究顯示，除了用來研究已知外源化合物的類固醇激素干擾效應(yīng)外，H295R細(xì)胞試驗(yàn)還可用來研究環(huán)境樣本中化合物的干擾效應(yīng)（Liu et al.，2018；Kim et al.，2014）。

本研究選取東莞市2種不同處理工藝的城市污水處理廠，采用體外細(xì)胞法對工藝流程污水樣品中的類固醇激素干擾物及雌激素活性物進(jìn)行評價(jià)；同時(shí)結(jié)合化學(xué)分析方法，檢測水中8種EDCs在工藝流程中的分布，進(jìn)一步闡明污水處理廠工藝對此類EDCs的去除效果。

1 材料與方法

1.1 材料

化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)材料：8種EDCs目標(biāo)物為壬基酚（Nonlyphenol，NP）、辛基酚（Octylphenol，OP）、雙酚A（Bisphenol A，BPA）、雌酮（Estrone，E1）、雌二醇（17β-Estradiol，E2）、雌三醇（Estriol，E3）、17α-乙炔基雌二醇（17α-Ethinglestradiol，EE2）和己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES）。甲醇與乙酸乙酯（HPLC級）購自Sigma Aldrich；玻璃纖維膜（GF/F，0.7 μm）購自Whatman；Oasis HLB固相萃取柱（500 mg，6 mL）購自Waters公司。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料：H295R、MVLN細(xì)胞獲贈于韓國首爾大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室（Kyungho Choi教授）。實(shí)驗(yàn)中使用的DMEM/F12培養(yǎng)基、丙酮酸鈉和胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）均購自 Gibco；碳吸附胎牛血清（charcoal-stripped FBS）、腺苷酸環(huán)化酶激活劑（Forskolin）和胰酶購自 Sigma；Nu-serum 和ITs+Premix購自 BD；雙抗和細(xì)胞級二甲基亞砜（DMSO）購自 Solarbio；ELISA 試劑盒（Estradiol 582251、Testosterone 582701）購自 Cayman Chemical；熒光素酶檢測試劑盒 Steady-Glo Luciferase購自 Promega；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit，CCK-8）購自同仁公司；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒和 SYBR Premix Ex TaqTM II酶（Tli RNaseH Plus）購自 Takara；RT-PCR 儀（Thermo Fisher公司），Synergy多功能酶標(biāo)儀（Bio Tek公司）。

1.2 采樣方法

1.2.1 樣品采集與前處理

選擇東莞市 2個(gè)污水處理廠（Wastewater treatment plants，WWTPs）作為研究對象，A 廠（WWTP A）采用A/A/O處理工藝，B廠（WWTP B）采用OD處理工藝（圖1），A廠取樣點(diǎn)包括格柵出水（A1）、好氧池（A2）和紫外消毒（A3）；B廠取樣點(diǎn)包括格柵出水（B1）、氧化溝（B2）及紫外消毒（B3）。于2017年3月采集水樣，為瞬時(shí)一次采樣。采集后，水樣儲存于2.5 L棕色玻璃瓶中，4 ℃保存，24 h內(nèi)完成處理。實(shí)驗(yàn)前分別用8 mL乙酸乙酯、甲醇與超純水活化固相萃取（HLB）柱。污水樣品經(jīng)過玻璃纖維濾膜過濾后，用活化后的HLB柱富集。15 mL乙酸乙酯分3次，每次5 mL淋洗，將淋洗液分成兩份，一份用氮?dú)鈨x吹脫干燥后用DMSO定容至1 mL，-20 ℃冰箱保存，用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（張秋亞等，2017）；另一份制成 1 mL濃縮液后分次轉(zhuǎn)移至250 μL內(nèi)襯管，用溫和氮?dú)饩徛蹈?，然后加?0 μL乙酸乙酯和100 μL衍生化試劑MSTFA，在70 ℃下反應(yīng)30 min，冷卻至室溫后加入一定量內(nèi)標(biāo)物（terphenyl-d14），最后用乙酸乙酯定容至200 μL，進(jìn)行GC-MS分析（龔劍等，2011）。

1.2.2 儀器分析

使用氣質(zhì)聯(lián)用 GC-MS法檢測水中常見 8種EDCs（BPA、NP、OP、DES、E1、E2、EE2、E3）濃度，分析方法見龔劍等（2011）。GC條件：載氣為氦氣，流速1 mL·min-1；水樣以無分流方式進(jìn)樣。程序升溫：初始溫度為50 ℃，保持 1 min，以 20 ℃·min-1升至 200 ℃，然后以 3 ℃·min-1升至 280 ℃保持 2 min，最后以 30 ℃·min-1升至290 ℃保持5 min。MS條件：傳輸線溫度為280 ℃，離子源溫度為250 ℃，離子源為電子轟擊源（EI），電子轟擊能量為 70 eV。采用全掃模式（m/z=50～550）對樣品進(jìn)行定性分析，采用選擇離子監(jiān)測模式（SIM）對樣品進(jìn)行定量分析。在分析過程中同時(shí)運(yùn)行QA/QC控制樣品：方法空白、空白加標(biāo)和樣品重復(fù)樣，并在分析前對所有樣品進(jìn)行添加回收率指示物標(biāo)樣。空白加標(biāo)中目標(biāo)化合物OP、NP、BPA、DES、E1、E2、EE2和E3的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）分別為(94.5%±4.4%)、(100.1%±7%)、(100.6%±8.8%)、(104.2%±17.4%)、(92.1%±8.8%)、(81.7%±2.9%)、(124.3%±10%)、(97.7%±12.2%)。方法空白中僅檢測出 NP和 BPA，平均質(zhì)量濃度分別為 1.6 ng·L-1和 10 ng·L-1，遠(yuǎn)低于樣品中的含量，已在樣品中扣除了空白。所有樣品中回收率指示物NP-d4、BPA-d16、E1-d4 的回收率分別為(90%±5.2%)、(93.6±8.1%)、(104.2%±10%)。NP和BPA的校正曲線線性范圍分別為 100～2000 ng·mL-1、20～500 ng·mL-1，其他目標(biāo)化合物的校正曲線線性范圍均為5～100 ng·mL-1，擬合度R2均大于0.99。BPA、NP、OP、DES、E1、E2、EE2、E3的檢出限 LOQ分別為＜1.0、5.0、1.6、＜1.0、1.5、1.1、3.0、3.2 ng·L-1。

圖1 春季A、B污水廠的工藝流程及采樣點(diǎn)設(shè)置Fig. 1 Process and sampling points setting of WWTP A and WWTP B plants in spring

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 H295R與MVLN細(xì)胞培養(yǎng)

H295R細(xì)胞完全培養(yǎng)基的配置：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液，加入 2.5%（V/V）Nu-serum、1%ITS-Premix及1%雙抗，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培育箱中傳代培養(yǎng)，每周換液2～3次。取對數(shù)生長期生長良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

MVLN細(xì)胞完全培養(yǎng)基配置：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入10% FBS、1%丙酮酸鈉、0.1%胰島素、0.5%雙抗。細(xì)胞置于 37 ℃、5% CO2培育箱中傳代培養(yǎng)。

1.3.2 H295R細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

H295R細(xì)胞是篩選環(huán)境類固醇激素干擾物的體外工具，本研究從激素和基因表達(dá)水平兩個(gè)層次檢測污水處理廠對此類干擾物的去除效果（周景明等，2009）。H295R 細(xì)胞以 3×105cells·mL-1接種于24孔板中（每孔1 mL），貼壁24 h后染毒。每個(gè)測試樣品準(zhǔn)備3個(gè)濃度梯度（100%、33%、11%），設(shè)置 DMSO溶劑對照組和空白對照組，以及陽性對照組（Forskolin處理），每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。為避免H295R細(xì)胞毒性的影響，首先進(jìn)行CCK-8細(xì)胞活力測試，在無毒劑量下（細(xì)胞存活率>80%）分析水中EDCs對H295R細(xì)胞類固醇激素雌二醇（下文簡稱E2）和睪酮（Testosterone，下文中簡稱T）的水平及基因表達(dá)量的影響（Liu et al.，2012）。染毒48 h后收集培養(yǎng)基用于檢測激素水平的變化，收集細(xì)胞用于檢測類固醇合成的基因表達(dá)量變化，檢測方法參照文獻(xiàn)（Huang et al.，2011）。簡而言之，培養(yǎng)液中E2和T經(jīng)乙醚萃取后采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進(jìn)行檢測。細(xì)胞中總RNA用Trizol試劑提取，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-PCR檢測。RT-PCR檢測的 10個(gè)類固醇合成基因?yàn)?StAR、HMGR、3βHSD2、CYP21、17βHSD4、17βHSD1、CYP19、CYP17、CYP11B2和CYP11A（Caron-Beaudoin et al.，2017；Kim et al.，2016），引物序列見表1。RT-PCR反應(yīng)體系（10 μL）：5 μL SYBR Green、1 μL cDNA 和 1 μL 正義/反義引物（表 1），DEPC水補(bǔ)足10 μL。RT-PCR程序：95 ℃保持30s，95 ℃ 30 s，60 ℃保持1 min，40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，倍數(shù)的變化采用 2-ΔΔCT法計(jì)算（Ding et al.，2007）。

表1 引物序列表Table 1 Sequence of all gene primers

1.3.3 MVLN細(xì)胞試驗(yàn)

利用 MVLN細(xì)胞檢測污水中雌激素受體誘導(dǎo)的雌激素效應(yīng)，為避免FBS中phenols對試驗(yàn)結(jié)果的影響，試驗(yàn)前24 h將FBS轉(zhuǎn)換成charcol-stripped FBS。試驗(yàn)時(shí)，MVLN細(xì)胞用胰酶消化后離心制備單細(xì)胞懸液，以1.25×105cells·mL-1接種于96孔培養(yǎng)板中（每孔250 μL），貼壁24 h后染毒72 h。每個(gè)測試樣品準(zhǔn)備4個(gè)濃度梯度(100%、33%、11%、3.4%)，設(shè)置DMSO溶劑對照組和空白對照組，每個(gè)濃度處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。為避免MVLN細(xì)胞毒性的影響，利用 CCK-8檢測細(xì)胞活力，在無毒劑量下（細(xì)胞存活率>80%），用Steady-Glo Luciferase檢測細(xì)胞內(nèi)熒光量。實(shí)驗(yàn)中將E2稀釋成6個(gè)濃度梯度（370、120、40、13、4、1.3 nmol·L-1），分別繪制劑量效應(yīng)圖，計(jì)算EC20（指毒性效應(yīng)達(dá)到20%的劑量或濃度），按如下公式計(jì)算樣品的雌二醇當(dāng)量（Estradiol Equivalency quotient，EEQ，ng·L-1）：

式中，EC20(S)為樣品中的EC20。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism軟件作圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示。組間差異采用單因素方差Dunnett法分析。兩個(gè)統(tǒng)計(jì)變量的相關(guān)性評價(jià)采用 Spearman相關(guān)分析。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05記作*，P＜0.01記作**）。

2 結(jié)果分析

2.1 化學(xué)分析結(jié)果

結(jié)果顯示，A、B污水廠進(jìn)水中OP、NP和BPA濃度最高（表2），其在A污水廠進(jìn)水中的質(zhì)量濃度分別為10782、9892、4543 ng·L-1，B污水廠中分別為2664、999、317 ng·L-1。A、B污水廠進(jìn)水中雌激素類化合物濃度較低，DES、EE2均低于檢出限。雌激素類物質(zhì)濃度最高的是A污水廠進(jìn)水中的E3，為24.5 ng·L-1。A、B兩污水廠對酚類的去除率均在90%以上，而A污水廠出水中NP、BPA、OP依然分別高達(dá)808、584、74.8 ng·L-1；B污水廠出水中NP、BPA、OP質(zhì)量濃度分別為61.8、12.6、5.6 ng·L-1。處理后，除E1在A污水廠出水中的質(zhì)量濃度高達(dá)0.8 ng·L-1，其他雌激素化合物在兩廠出水中均低于檢出限，去除率達(dá)到100%。

2.2 H295R細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CCK8細(xì)胞毒性測試結(jié)果顯示，所有樣品及其稀釋樣對H295R與MVLN細(xì)胞無細(xì)胞毒性作用。

表2 兩污水處理廠中8種EDCs在各個(gè)處理階段的濃度及整體去除率Table 2 Concentrations and overall removal of eight EDCs in each treatment processes of two wastewater treatment plants

ELISA結(jié)果顯示，A污水廠3個(gè)采樣點(diǎn)水樣初始濃度處理后E2水平均顯著升高，T濃度水平呈下降趨勢。B污水廠中進(jìn)水B1及出水B3采樣點(diǎn)水樣初始濃度處理下E2水平均顯著上升，T濃度水平?jīng)]有顯著變化或呈輕微的下降趨勢。兩污水廠間類固醇激素的變化沒有顯著差異（圖2）。

圖2 污水處理廠各采樣點(diǎn)水樣萃取物暴露后對H295R細(xì)胞中E2、T濃度的影響Fig. 2 Effects of WWTPs water sample raw extract on E2 and T level in H295R cell bioassay

A、B兩污水廠水樣經(jīng)有機(jī)萃取后，類固醇基因StAR、17βHSD4、17βHSD1和CYP11A的表達(dá)沒有顯著變化（表3），HMGR、CYP11B2和CYP19基因表達(dá)均顯著上升，而3βHSD2、CYP17和CYP21基因表達(dá)量在A廠污水處理后顯著下降而在B廠出廠水處理后顯著上升（圖3）。

表3 污水萃取物對H295R細(xì)胞10種類固醇激素合成基因的表達(dá)量影響Table 3 Effects of water sample raw extracts on 10 major steroidogenesis gene expression in H295R cell

2.3 MVLN細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

MVLN細(xì)胞染毒72 h后，檢測熒光量，計(jì)算雌激素當(dāng)量EEQ值。結(jié)果顯示，A廠中EEQ值先上升后下降，A2處的雌激素活性最高，達(dá) 48.86 ng·L-1；B廠從B1到B3，雌激素活性依次下降。A、B廠出水EEQ分別為19.25、14.21 ng·L-1（表4）。

表4 A、B兩廠各個(gè)處理階段的EEQTable 4 EEQ in each treatment phase of WWTP A and WWTP B ng·L-1

2.4 相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，春季A、B廠酚類物質(zhì)OP、NP、BPA與E2濃度的變化沒有顯著相關(guān)性（P>0.05）（圖4）；烷基酚類物質(zhì)（OP與NP相加之和）與E2濃度的變化也沒有顯著相關(guān)性（P>0.05）（圖5）。

3 討論

圖3 污水處理廠各采樣點(diǎn)水樣萃取物暴露后對H295R細(xì)胞中類固醇合成基因表達(dá)量的影響Fig. 3 Effects of WWTPs water sample raw extracts on the expression of steroidogenesis genes in H295R Cells

圖4 OP、NP、BPA在春季A、B廠中各個(gè)處理階段的濃度與E2濃度變化的相關(guān)性分析Fig. 4 Correlation between concentrations of OP, NP, BPA and concentration of E2 in WWTP A and WWTP B plants

圖5 烷基酚（Alkyl phenol，AP）在A、B廠中各個(gè)處理階段的濃度與E2濃度變化的相關(guān)性分析Fig. 5 Correlation between concentrations of AP and concentration of E2 in WWTP A and WWTP B plants

兩污水處理廠進(jìn)水中均測出高濃度的酚類化合物，而雌激素化合物濃度較低。NP在A、B污水廠進(jìn)水中分別高達(dá) 10782 ng·L-1，2664 ng·L-1，高于云南、浙江等其他污水廠進(jìn)水中的濃度（Huang et al.，2014；Lv et al.，2016）。此外，BPA及OP的濃度也高于其他污水中濃度，而A、B污水廠中雌激素化合物在進(jìn)水中的濃度均低于北京、捷克、阿根廷等其他污水廠（Garriz et al.，2015；Vymazal et al.，2015；Zhou et al.，2012）。王凌云等（2012）等報(bào)道深圳污水廠進(jìn)水中EE2含量高達(dá)60.4～895.5 ng·L-1，而 NP 含量較低（8.1～34.6 ng·L-1）。經(jīng)過處理后，A、B污水廠出水中酚類濃度依然很高，尤其是 A污水廠出水中 NP、BPA濃度分別高達(dá)808、584 ng·L-1，遠(yuǎn)高于受體水域東江中此類化合物的濃度（周自嚴(yán)，2015）。龔劍等（2011）研究發(fā)現(xiàn)在東莞東河段的沉積物中 BPA的污染水平高于珠江廣州河段，天然雌激素類物質(zhì)則在珠江廣州河段污染較嚴(yán)重。本研究顯示，東莞污水排放可能是導(dǎo)致這種分布特征的原因之一。BPA是工廠生產(chǎn)聚碳酸酯塑料、鋁罐的原材料之一；而NP主要來源于工廠生產(chǎn)烷基酚乙氧酚表面活性劑的代謝物（Jagne et al.，2016）。A污水廠中的EDCs含量整體高于B污水廠，可能與A污水廠經(jīng)常受到工業(yè)廢水污染有關(guān)。生物降解法主要是通過污泥吸附與生物降解的作用實(shí)現(xiàn)對EDCs的去除。有研究顯示，污水處理工藝及處理時(shí)的溫度、pH值、季節(jié)、污泥停留時(shí)間等均會影響有機(jī)污染物的去除效果（Nie et al.，2012）。本研究中，A/A/O和OD污水處理工藝對BPA、OP和NP等不同EDCs均有較高的去除率，去除率達(dá)90%以上，對雌激素類物質(zhì)去除率達(dá)到100%，而Huang et al.（2014）研究顯示，A/A/O法對EE2的去除率僅為75.4%。Xu et al.（2012）研究發(fā)現(xiàn)，在水力停留時(shí)間為1 h的條件下，活性污泥法對E2的去除率為95%，在水力停留時(shí)間為5 h時(shí)去除率可達(dá)100%。同等條件下，同一類物質(zhì)受季節(jié)影響去除率也各不相同。冬秋季溫度低，降低了污泥中酶的活性，間接影響去除率的高低。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，BPA在夏季的去除率為99%，而在冬季的去除率僅為44%；EE2在夏季的去除率為100%，而在秋季的去除率僅為75.7%（Nie et al.，2012）。

H295R細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A、B污水廠進(jìn)水粗提物經(jīng)處理后，相比于對照組，E2濃度顯著增加而T濃度呈下降趨勢，出水粗提物經(jīng)處理后，與進(jìn)水的變化一致，提示經(jīng)過處理后，A、B污水廠對通過內(nèi)固醇激素途徑導(dǎo)致的雌激素效應(yīng)物的去除效率不高。Kim et al.（2014）利用H295R細(xì)胞研究了鋼鐵廠污水及城市污水的內(nèi)分泌干擾活性，也觀察到了類似的現(xiàn)象，并推測產(chǎn)生這個(gè)效應(yīng)的主要物質(zhì)是水中多環(huán)芳烴類及酚類物質(zhì)。而本研究中，A、B污水廠出水粗提物中依然存在較高濃度的BPA、NP和OP，這些化學(xué)物單獨(dú)處理H295R細(xì)胞后，通過不同的機(jī)制導(dǎo)致 E2濃度的上升（Bistakova et al.，2017）。雖然化學(xué)分析結(jié)果顯示，相對于進(jìn)水，出水中酚類化合物濃度均大大降低，但通過內(nèi)固醇途徑產(chǎn)生的雌激素效應(yīng)沒有顯著降低，說明出水中BPA、NP和OP的濃度較高。此外，污水中其他具有此類雌激素效應(yīng)的污染物如多環(huán)芳烴等不容忽視（Villeneuve et al.，2002）。生物學(xué)方法與化學(xué)方法的相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，春季A、B污水廠酚類物質(zhì)OP、NP、BPA與E2濃度變化無相關(guān)關(guān)系，提示兩個(gè)污水處理廠出水中除了酚類化合物，其他可干擾類固醇激素合成通道的化合物或者酚類化合物的混合效應(yīng)不容忽視。

類固醇合成基因表達(dá)量檢測結(jié)果顯示，A、B污水廠的出水處理后HMGR、CYP19、CYP11B2表達(dá)量顯著上升，與E2濃度增加的結(jié)果吻合。HMGR基因表達(dá)的是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，是一種催化膽固醇合成的限速反應(yīng)酶（Wang et al.，2015），CYP19基因表達(dá)的芳香化酶可催化睪酮轉(zhuǎn)化為雌二醇（Lee et al.，2013；Ding et al.，2007），這兩個(gè)基因的高表達(dá)解釋了 E2濃度的增加；而CYP11B2基因的高表達(dá)揭示除性激素外，污水中還有一些化合物可通過醛固醇激素水平，影響機(jī)體正常的代謝平衡（Kang et al.，2016）。3βHSD2、CYP17和CYP21是類固醇合成通道上3個(gè)重要的基因，這3種基因在A3處高表達(dá)而在B3處低表達(dá)，揭示A、B污水廠中類固醇激素合成干擾物的干擾機(jī)制并不完全一致。

MVLN細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A污水廠中的雌激素活性呈先上升后下降趨勢，出水A3處的EEQ跟進(jìn)水A1處一樣，而B污水廠中隨著雌激素的降解或吸附，雌激素活性降低，B3處的雌激素活性明顯低于 B1。張照韓等（2011）研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過二沉池后EEQ輕微上升，推測可能是沉降過程中，污泥中所含的雌激素活性物質(zhì)重新溶解所致。而本研究中，A污水廠進(jìn)入二沉池后EEQ明顯下降，推測可能是吸附在污泥上的雌激素活性物隨著污泥沉淀而致。楊先海等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)包括 BPA也具有雌激素活性。雖然化學(xué)分析結(jié)果顯示，處理后酚類化合物和雌激素化合物濃度均呈顯著降低，但是雌激素活性并沒有降低，A、B污水廠出水中EEQ分別高達(dá)19.25、14.21 ng·L-1，明顯高于其他污水處理廠出廠水 EEQ及自然水域中EEQ（張秋亞等，2017；李紅萍等，2016；劉蕓等，2011）。隋倩等（2009）等通過對4類32種EDCs的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)熵和雌二醇當(dāng)量濃度進(jìn)行評分和排序，得出炔雌醇、雌酮、壬基酚、雙酚A是中國城市污水處理廠優(yōu)先控制的4種污染物。本研究結(jié)果顯示，A、B污水廠中優(yōu)先控制的污染物是壬基酚和雙酚A。雖然化學(xué)分析結(jié)果顯示A、B污水廠出廠水中雌激素化合物已經(jīng)基本去除，但是雌激素效應(yīng)依然存在。究其原因，OP、NP或BPA也具有雌激素受體結(jié)合活性（Laws et al.，2000）。此外，李清雪等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，污水廠中含有高濃度的多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、鄰苯二甲酸酯類、酚類和有機(jī)氯農(nóng)藥，這些化合物具有不同程度的雌激素效應(yīng)（Tiwari et al.，2016）。

4 結(jié)論

化學(xué)分析結(jié)果顯示，兩個(gè)污水廠進(jìn)水中 3種酚類化學(xué)物濃度較高，而5種雌激素化學(xué)物濃度較低，污水廠對這8種常見EDCs的去除主要發(fā)生在生物處理階段，去除率均超過 90%。雖然去除效果較好，但是污水中尤其是A污水廠進(jìn)水中3種酚類化合物濃度高，且出水中濃度依然較高，應(yīng)作為A污水廠去除控制重點(diǎn)。H295R與MVLN細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，污水處理廠出廠水中類固醇激素合成干擾效應(yīng)及雌激素活性依然存在。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，類固醇激素水平與水中酚類物質(zhì)濃度沒有顯著的相關(guān)性。相對于化學(xué)分析，生物學(xué)效應(yīng)更能體現(xiàn)污水廠的出水中EDCs可能引起的生態(tài)與健康風(fēng)險(xiǎn)。