李高華 葉啟發(fā)楊翼

1武漢體育學院研究生院（湖北武漢430079）

2河南農(nóng)業(yè)大學體育學院

3武漢大學中南醫(yī)院

4武漢體育學院健康科學學院

為了通訊和組織穩(wěn)態(tài)的需要，細胞在靜息狀態(tài)或不同的刺激下均會分泌胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）。EVs存在于所有的體液中，其出現(xiàn)與特殊的生理和病理狀態(tài)相關(guān)[1]。EVs主要分為外泌體（exosomes，EXs）和微囊泡（microvesicles，MVs），當前研究最多的是EXs。已證實EXs含有多種參與生理和病理過程的多肽、miRNA、mRNA和線粒體DNA，借助于它們在細胞和組織之間實現(xiàn)通訊交流[2]。運動帶來的系統(tǒng)性益處可能是通過EXs以自分泌、旁分泌和/或內(nèi)分泌方式進行調(diào)節(jié)的，在對運動的應答中，循環(huán)中EXs的內(nèi)含物可以強度依賴性方式增加[3]，從而在代謝性疾病的防治中發(fā)揮作用。

1 EXs的來源及其生物學特性

1.1 EXs的來源

外泌體（exosomes，EXs）最初用來定義不同培養(yǎng)細胞所分泌的直徑范圍在40～1000 nm的囊泡[4]，后來這個命名被網(wǎng)織紅細胞分化過程中由多囊體與細胞膜融合后釋放的直徑40～100 nm的胞外囊泡（EVs）所采用。研究證實多種細胞（B淋巴細胞、樹突狀細胞、細胞毒性T細胞等）在正常生理及病理狀態(tài)下均可通過相似的途徑分泌EXs[5-8]，此外，EXs已成功從不同體液中提取出來，包括血漿、血清、唾液、羊水、乳汁、尿液、腹水和腦脊液[9-11]。

1.2 EXs的生物合成和分泌

在早期核內(nèi)體向晚期核內(nèi)體發(fā)育成熟過程中，晚期核內(nèi)體界膜內(nèi)陷出芽形成管腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicles，ILVs）[12]。這些ILVs轉(zhuǎn)變?yōu)閬喖毎Y(jié)構(gòu)的多囊體（multi-vesicle bodies，MVBs）并與質(zhì)膜融合，釋放EXs到胞外環(huán)境中[13]。多囊體里面EXs的形成很大程度上依賴于保守的ESCRT蛋白，它由4種可溶性多蛋白復合體組成（ESCRT-0、-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ）[9，14]。泛素化蛋白與凋亡連接基因2相互作用蛋白X（apoptosislinked gene-2-interacting protein X，ALIX）、腫瘤易感基因 101（tumor susceptibility gene101，TSG101）及ESCRT-Ⅰ復合物結(jié)合，激活了ESCRT-Ⅱ，隨后導致低聚化和ESCRT-Ⅲ復合物的形成[14]。該復合物參與了運載蛋白的導入和分揀，并進入腔內(nèi)囊泡，最終成為EXs。EXs分泌以結(jié)構(gòu)性和調(diào)節(jié)性方式進行，在對胞外信號如ATP、神經(jīng)遞質(zhì)、去極化、凝血酶受體激活、脂多糖等的反應中通過Ca2+信號或細胞應激來控制[15-17]，最終分泌到胞外環(huán)境中。

1.3 EXs分子組成和生物學特性

Exs含有的特異性蛋白成分包括：ALIX、TSG101、網(wǎng)格蛋白（clathrin）、整合蛋白（integrins）、跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81和CD82）以及轉(zhuǎn)運和融合蛋白：脂筏標記蛋白（flotillin）、鳥苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase，GTPase）、膜聯(lián)蛋白（annexins）；EXs中的脂質(zhì)成分包括：ALIX相互作用的溶血磷脂酸、磷脂酰絲氨酸、神經(jīng)酰胺、鞘脂類和磷脂酰甘油[18]。此外，EXs還攜帶多種特異性分子，包括mRNA、miRNA、少量的DNA、轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子、生長因子等[19]。

EXs分泌到胞外環(huán)境中可以導致受體細胞生理或病理過程發(fā)生改變。除此之外，它們還帶有與其來源細胞相關(guān)的生物分子，這有助于它們的識別，通過與受體相互作用激發(fā)信號級聯(lián)反應，與特異性靶細胞相互作用并參與細胞間的通訊[20]。

2 EXs的作用機制和功能

2.1 EXs的作用機制

許多疾病的進程都有EXs的參與，但EXs對受體細胞的作用機制還不太清楚。近年來，EXs信號通路和作用機制被廣泛研究，尤其是在與之相關(guān)的各種病理作用和生物標志物方面[13，21，22]。EXs可以通過以下3種途徑發(fā)揮生物學作用（圖1）：（1）通過表面相關(guān)分子參與抗原遞呈或通過受體細胞膜上的受體活化參與信號傳導；（2）通過特異性受體與受體細胞膜綁定，受體細胞通過內(nèi)吞作用將EXs內(nèi)化；（3）EXs與受體細胞直接融合并將內(nèi)含物釋放入受體細胞胞質(zhì)。

圖1 Exs作用于受體細胞發(fā)揮生物學作用的三種方式（引自Mirja Krause[23]，略有改動。）

2.2 EXs的功能

最早認為EXs是細胞排泄廢物的一種方式[24]，隨著對其生物來源、物質(zhì)構(gòu)成及運輸、細胞間的信號傳導以及在體液中分布的大量研究發(fā)現(xiàn)，EXs具有多種多樣的功能。大量研究主要集中于對多種疾病的診斷、疫苗的開發(fā)、抗腫瘤和抗炎癥的臨床治療等方面。比如EXs能夠參與抗原遞呈激活抗腫瘤免疫反應[25]，腫瘤細胞分泌的EXs通過血管生成和腫瘤細胞遷移促進腫瘤的發(fā)展[26]；樹突狀細胞和腸上皮來源EXs對巨噬細胞功能具有促進作用[27，28]；支氣管肺泡液中的EXs與呼吸道上皮細胞促炎癥細胞因子分泌相關(guān)[29，30]。此外，心肌內(nèi)注射來源于低氧暴露12小時的心肌祖細胞的EXs可以改善心臟功能，并降低心肌纖維化[31]。

3 EXs在代謝性疾病中的作用

3.1 EXs可作為代謝性疾病的診斷標志物

研究表明，在肥胖以及相關(guān)的胰島素抵抗、糖尿病和非酒精性脂肪肝等疾病中，循環(huán)EXs水平均出現(xiàn)升高[32，33]，并且代謝綜合癥、2型糖尿病、高膽固醇血癥和高血壓患者具有不同的EXs miRNA特征[34]。脂肪細胞來源的EXs與脂代謝、肥胖相關(guān)的胰島素抵抗相關(guān)[35]。肥胖大鼠和人的脂肪細胞分泌EXs的數(shù)量與其對依賴脂肪酸氧化的細胞遷移作用是一致的[36]。與皮下脂肪干細胞相比，肥胖者腹腔大網(wǎng)膜脂肪干細胞來源的EXs及其包裹的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）濃度升高[37]。值得注意的是，這些患者進行能量限制或肥胖手術(shù)后EXs的水平出現(xiàn)了顯著性下降[38]。

由此可以看出，EXs水平與代謝性疾病相關(guān)。EXs的成分反映了其來源細胞的功能狀態(tài)，甚至包含病態(tài)細胞的相關(guān)分子信息[39]，不同疾病的細胞都能分泌含有特定RNAs的EXs[40]。因此檢測體液中的EXs，對其進行RNA組成分析，有助于代謝性疾病的臨床診斷和預后判斷。

3.2 EXs在代謝性疾病中發(fā)揮作用的相關(guān)機制

在代謝性疾病中，EXs能夠轉(zhuǎn)運功能性mRNA、miRNA、細胞因子和生長因子，激活靶細胞的下游信號通路，影響該疾病的發(fā)生和發(fā)展。

在代謝性疾病中研究最多的是脂肪細胞來源的EXs。肥胖者內(nèi)臟脂肪細胞來源的EXs攜帶miRNA（miR-23b、miR-148b、miR-4269、miR-4429）可定向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和經(jīng)典的Wnt信號通路（wnt/β-catenin），在脂肪分布、脂肪細胞分化、終末器官炎癥和纖維化信號中起作用[41]。這些EXs進入肝細胞誘導TGF-β信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)異?？赡苁欠蔷凭灾靖蔚陌l(fā)病機制[42]。而且脂肪細胞分泌的EXs能夠被外周血單核細胞攝取并分化成活化的巨噬細胞，進一步促進TNF-α（tumour-necrosis factor-α）和IL-6的分泌，調(diào)節(jié)肥胖和胰島素抵抗。在體外實驗中，脂肪細胞來源外泌體對代謝性疾病的作用也得到了證明。如注射肥胖小鼠脂肪細胞來源的EXs能夠引起正常小鼠的胰島素抵抗，其可能的機制是EXs介導了巨噬細胞活化，削弱了肌細胞對胰島素的反應和對葡萄糖的攝取[43]；也有研究認為這種EXs攜帶的miR33a和miR-374b介導了脂肪組織和巨噬細胞之間的通訊，并降低了巨噬細胞膽固醇逆向轉(zhuǎn)運基因的表達，最終引起肥胖相關(guān)的動脈粥樣硬化[44]。

此外，學者對胰島素抵抗和糖尿病大鼠來源的EXs進行了代謝性疾病的相關(guān)機制研究。高脂喂養(yǎng)誘導的胰島素抵抗和2型糖尿病大鼠分泌的EXs，能夠誘導體外實驗中大鼠心臟血管內(nèi)皮細胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）的表達和活性氧類（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，二者都是糖尿病內(nèi)皮功能障礙的主要信號中介[45]。Jalabert等[46]用同樣高脂飼料誘導的糖尿病鼠模型發(fā)現(xiàn)，肌肉來源的EXs能在肌肉細胞之間轉(zhuǎn)移軟脂酸和油酸，在胰島素抵抗發(fā)生中轉(zhuǎn)移信號物質(zhì)到胰腺β細胞，并且證明了EXs在胰島素抵抗過程中有助于β細胞的適應。為了對比健康個體EXs的良性作用，Jansen等[47]證明來源于健康大鼠血管內(nèi)皮細胞的EXs能通過轉(zhuǎn)運miR-126修復受損的內(nèi)皮組織，來源于心肌細胞的EXs則具有促血管生成，刺激內(nèi)皮細胞增殖、遷移以及管腔形成的作用。而糖尿病大鼠來源的EXs具有相反的作用，其原因可能是心肌細胞EXs miR320被轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細胞，從而下調(diào)IGF-1、HSP20以及Ets-2的表達，導致內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔形成的抑制。因此該研究提出了一個可能的新機制，即糖尿病心肌血管生成損傷可能是由心肌細胞分泌的抗血管生成的EXs引起的[48，49]。

在體外實驗研究中，EXs通過干擾素-γ激活信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）、脂質(zhì)激活Notch信號通路等，從而從不同途徑影響代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展[50，51]。

總之，這些前期的研究結(jié)果從不同角度闡釋了EXs在代謝性疾病中的作用機制，可能通過EXs攜帶的miRNA或蛋白成分介導了代謝性疾病發(fā)生發(fā)展中的信號通路，為進一步通過EXs進行代謝性疾病的治療奠定了基礎。

4 運動介導的EXs在代謝性疾病中的調(diào)控作用

運動是代謝性疾病非藥物治療的首選方法，尤其是耐力運動，能改善肥胖和糖尿病人群的血糖控制和胰島素敏感性[52]。雖然運動促代謝的多系統(tǒng)效應已被證實，但是運動對改善代謝性疾病的潛在分子機制還未完全闡明。有學者提出積極調(diào)節(jié)代謝性疾病的運動因子exerkines（即由于對運動的應激而釋放到循環(huán)中以促進器官間信息通訊并增強全身系統(tǒng)性益處的肽類和miRNAs等分子物質(zhì)）存在于EXs中，那么將來相關(guān)疾病的治療可能涉及到富含exerkines的EXs的修飾或改變[53]。

EXs的分泌受體內(nèi)外環(huán)境的影響而改變[20]。體外實驗表明，受到缺氧刺激后細胞分泌EXs的成分發(fā)生改變[54]，進而促進損傷組織的修復。體內(nèi)實驗則證實，心肌組織缺氧后分泌的EXs改變了miRNA成分，調(diào)節(jié)miRNA可以起到有益的作用[31]。缺氧是大強度運動對機體造成的良性刺激，運動中EXs的釋放是否具有類似潛在的益處值得運動醫(yī)學領(lǐng)域?qū)W者的深入研究。

4.1 EXs是Exerkines的良好載體

細胞外環(huán)境不是Exerkines存在的適宜環(huán)境，由于EXs獨特的包裝保護作用，使這些exerkines免受核糖核酸酶的影響[14]，故通過EXs轉(zhuǎn)運這些物質(zhì)成為可能[2]。最近研究表明，miRNAs能夠被EXs吸收并分泌到循環(huán)中或者從循環(huán)中攝入細胞，以受體依賴和非依賴的方式影響受體細胞，可促進多肽、miRNA、mRNA和線粒體DNA在細胞和組織之間交流，把信息傳遞給其他細胞[2]。運動導致富含miRNAs的EXs從運動的骨骼肌釋放到循環(huán)、血管或脂肪組織，促進器官間的信息通訊，并控制基因的表達[55]。研究進一步揭示了EXs攜帶的特異性 miRNAs，如 miR-1、miR-2、miR-133、miR-182和miR206通過靶向肌細胞并改變基因表達來參與肌細胞的生理和病理狀態(tài)調(diào)節(jié)[56]。這為EXs成為exerkines的良好載體提供了確鑿證據(jù)。

4.2 運動中EXs的分泌及其作用

規(guī)律性運動能使肌肉代謝和心血管系統(tǒng)產(chǎn)生適應，影響機體長期的動態(tài)平衡過程。EXs作為信號媒介，介導了局部或遠距離的適應性反應，在生理或病理方面產(chǎn)生了廣泛的影響[9，57]。骨骼肌不僅是人體最重要的運動器官，也是活躍的內(nèi)分泌器官，肌肉因子（myokines）不僅可以作用于骨骼肌本身，還可通過血液循環(huán)到達外周，作用于肝臟、脂肪、心臟等器官，調(diào)節(jié)機體代謝[58]。通過對骨骼肌分泌的因子進行蛋白組學分析，確認437種蛋白有65.3%存在于EXs中[59]。證據(jù)顯示，由骨骼肌分泌的myokines（IL-4、IGF-1、irisin等）和脂肪組織產(chǎn)生和分泌的肽類物質(zhì)（leptin、adiponectin、TNF-α等）在運動干預糖尿病、血脂異常和肥胖等機制中參與了相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)[58，60-64]。因此，運動介導的EXs可能成為治療代謝性疾病的潛在靶點。

當前有關(guān)運動和EXs的研究較少，主要集中在不同運動類型和強度對血漿EXs的影響。Fruhbeis等[1]研究了一次性運動對EXs分泌的影響，結(jié)果表明，與安靜狀態(tài)對比，運動可促使EXs快速釋放到循環(huán)當中。據(jù)此推測，在運動介導的身體適應過程中，EXs的釋放可能參與了細胞通訊，并影響了組織和器官間的信號交互作用。該研究還發(fā)現(xiàn)，EXs分泌受運動類型的影響，相比于自行車而言，跑臺運動引起的EXs釋放更持久，這可能與機體參與跑臺運動的肌肉更多有關(guān)。此外，EXs在無氧閾出現(xiàn)之前已經(jīng)釋放，似乎沒有受到乳酸積累和血液酸化的影響，說明誘導EXs釋放的潛在因素很可能在運動的有氧期間已開始起作用[1]。Safdar等[2]用免疫組織化學方法，發(fā)現(xiàn)在一次性耐力運動后骨骼肌中ALIX顯著減少，表明EXs分泌到了循環(huán)系統(tǒng)中。結(jié)合另外一項研究結(jié)論——骨骼肌來源的EXs進入其他外周組織，并直接調(diào)節(jié)糖的攝取和代謝平衡[65]，可以推測耐力運動對代謝性疾病的調(diào)控作用可能是通過骨骼肌分泌的EXs介導的。

Barone等[66]對單次運動引起的EXs釋放進行了更為深入的研究，發(fā)現(xiàn)運動介導的EXs通過攜帶HSP60進入血液激活PGC1α1，進而使線粒體增加并調(diào)節(jié)細胞的能量代謝，從而有利于肌肉功能的提高，并與代謝性疾病的發(fā)病機制相關(guān)[67]，推測存在于胞外和血液中的EXs可能參與了細胞間通訊，介導了運動對代謝性疾病的有益調(diào)節(jié)。

在劇烈或中等強度運動時，運動后出現(xiàn)血小板和內(nèi)皮細胞來源的EXs增加[68-70]，運動導致的血液對血管內(nèi)皮細胞的剪切力刺激內(nèi)皮細胞分泌EXs并轉(zhuǎn)移到平滑肌細胞，從而介導了抗動脈粥樣硬化的功能[71]。Chaturvedi等[63]以2型糖尿病小鼠為模型進行為期8周的有氧運動后發(fā)現(xiàn)，心臟分泌的EXs含有較高的miR-455和miR-29b，它們結(jié)合在基質(zhì)金屬蛋白酶9基因（matrix metalloprotein-9，MMP9）的3’非翻譯區(qū)域下調(diào)其表達。而MMP9的降低參與了胞外基質(zhì)代謝并阻止了心肌纖維化和心肌細胞解偶聯(lián)，因此可能參與了運動改善糖尿病心血管并發(fā)癥的血脂異常和高胰島素血癥。Lancaster等[72]從運動與熱休克蛋白72（HSP72）的釋放方面進行綜述，指出EXs是運動誘導的HSP72的釋放媒介，對增強免疫、維持細胞穩(wěn)態(tài)和保護細胞免于各種應激起作用。細胞中HSP72的高表達可抑制應激活化蛋白激酶（JNK）信號轉(zhuǎn)導[73]，而JNK通過影響胰島素受體底物-1（IRS-1）絲氨酸307磷酸化，減弱IRS-1磷酸化造成胰島素敏感性降低[74]。這為運動誘導EXs通過HSP72治療糖尿病提供了可能的證據(jù)。

肖俊杰等[75]的研究表明，3周游泳運動誘導的EVs的增加（增加1.85倍）增強了小鼠內(nèi)源性EVs對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。更有意義的是，提取運動干預小鼠的血清EXs，通過心肌內(nèi)注射到再灌注損傷小鼠，同樣表現(xiàn)出類似的心肌保護作用。其中的信號通路可能是運動誘導的EVs通過激活ERK1/2和HSP27磷酸化介導了過氧化氫處理的H9C心肌細胞的抗凋亡，從而對心肌損傷產(chǎn)生保護效應。

綜上所述，當前有關(guān)運動和EXs的研究文獻雖然較少，但是已經(jīng)為EXs在運動醫(yī)學領(lǐng)域的研究揭開了新的篇章。這些研究涉及運動強度、運動方式、運動類型以及運動時間與EXs分泌的量效關(guān)系，并從相關(guān)蛋白信號和miRNAs方面探討了EXs對代謝性疾病的潛在作用機制。雖然結(jié)果不盡一致，但可以肯定的是，運動是促進EXs大量釋放的重要因素。在運動過程中，機體生理狀態(tài)的激活引起急性應激，這種應激反應促進了EXs的釋放。將來的研究需要關(guān)注長期運動、抗阻運動對EXs的影響及其對代謝性疾病的作用機制，并借助于分子生物學、蛋白組學、基因組學和脂類組學等技術(shù)研究運動過程中EXs釋放的細胞來源、分子組成、作用靶標以及介導代謝性疾病的信號通路，為運動介導的EXs在代謝性疾病中的作用提供強有力的證據(jù)。

5 小結(jié)

由于EXs具備作為疾病診斷標志物和藥物載體的潛力，近年來引起了醫(yī)學界的極大關(guān)注。而運動作為機體的一種良性刺激勢必與EXs分泌相聯(lián)系。假設運動防治代謝相關(guān)疾病是由EXs釋放其中的運動因子來介導的，那么運動—EXs—代謝性疾病之間就可以建立密切聯(lián)系。隨著研究的深入，運動與EXs之間的量效關(guān)系及其在代謝性疾病中的作用機制將為代謝性疾病的運動干預防治機理研究提供新的視角。