陸佳運(yùn)，宋劍波,2，王曉彥，莫小為，王碎抗，許欣彤，勞康文，莫蓓莘

1)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東省植物表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060；2)江西農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江西南昌330045

核苷酸轉(zhuǎn)移酶(nucleotidyl transferase protein，NTP) 蛋白是一類包含有poly(A) 聚合酶和末端核甘酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的蛋白，在真核生物中核苷酸轉(zhuǎn)移酶可以催化核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)的非模版加尾，從而增強(qiáng)或減弱RNA的穩(wěn)定性[1-3]．根據(jù)底物的不同，核苷酸轉(zhuǎn)移酶可分為尿苷酸轉(zhuǎn)移酶、腺苷酸轉(zhuǎn)移酶、胞苷酸轉(zhuǎn)移酶和胸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶．核苷酸轉(zhuǎn)移酶在人類[4]、酵母[5]、藻類[6]、果蠅[7]和線蟲中[8]均有研究．植物核苷酸轉(zhuǎn)移酶最早在擬南芥(Arabidopisisthaliana，At)中被發(fā)現(xiàn)[9-10]，擬南芥中HESO1(HEN1 SUPPRESSOR1)能夠催化非甲基化的miRNA 3′端非模板地添加尿苷酸，從而促進(jìn)miRNA的降解．隨后，擬南芥中與HESO1有協(xié)同作用的另一個(gè)核苷酸轉(zhuǎn)移酶URT1(UTP：RNA URIDYLTRANSFERASE1)也被發(fā)現(xiàn)，URT1能對非甲基化的miRNA以及mRNA 3′端非模板地添加尿苷酸，從而影響RNA的穩(wěn)定性[11-14]．除了HESO1和URT1外，擬南芥中還有8個(gè)NTP相關(guān)基因，其功能還有待研究[12]．核苷酸轉(zhuǎn)移酶在不同的植物中是很保守的，說明它們可能具有重要的生物學(xué)功能．

植物的生長依賴于光、溫度、水分、空氣和有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)．由于植物不可移動的特點(diǎn)，外界環(huán)境的脅迫會影響植物生長發(fā)育．各種脅迫對植物的影響往往同時(shí)發(fā)生，植物細(xì)胞內(nèi)一系列的基因調(diào)控和變化具有“cross talk”現(xiàn)象[15]．如干旱脅迫會使植物矮小、根系減少[16 ]；植物激素脫落酸(abscisic acid，ABA)與冷、干旱、鹽、重金屬脅迫有明顯關(guān)系[17]．對水稻(Oryzasativa，Os)的研究發(fā)現(xiàn)，水稻中的NTP蛋白在非生物脅迫條件下被誘導(dǎo)表達(dá)[18]，說明水稻的NTP基因可能參與了植物抗逆過程．玉米(Zeamays，Zm)是世界主要糧食作物之一，研究NTP相關(guān)基因與玉米植株抗逆之間的關(guān)系對提高玉米對逆境脅迫的耐受性及現(xiàn)代化育種具有重要指導(dǎo)意義．

1 材料與方法

1.1 材料及玉米NTP相關(guān)數(shù)據(jù)來源

利用Hmmer 3.0 (http://hmmer.janelia.org/)尋找玉米蛋白組中含有核苷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(PF01909) 的NTP蛋白. 核苷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(PF01909)來源于 Pfam 數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org)．玉米和擬南芥基因以及蛋白序列信息分別從玉米數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(https://www.maizegdb.org/)以及擬南芥信息資源網(wǎng)站(http: //www.arabidopsis.org/)下載．水稻蛋白信息來源于植物基因組學(xué)網(wǎng)站(https:/ /phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal．html)， 玉米B73種子為本課題保存．

1.2 玉米NTP蛋白的序列分析結(jié)果分析

利用MEGA5.0軟件neighborjoining法則的P距離(P-distance)模型構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap method值為1 000．利用Plantcare軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動子上游順式作用脅迫元件．

1.3 非生物脅迫下NTP基因的表達(dá)分析

玉米幼苗在霍格蘭德營養(yǎng)液中培養(yǎng)兩周后分別進(jìn)行：① 高鹽處理．將幼苗轉(zhuǎn)移到含300 mmol/L氯化鈉的霍格蘭德營養(yǎng)液中，分別處理0、3、6和12 h，兩株幼苗為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，收取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)．② 干旱處理．將幼苗轉(zhuǎn)移至濾紙上，分別處理0、3、6和12 h，兩株幼苗為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，收取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)．③ ABA處理．將濃度為100 μmol/L的ABA溶液均勻噴灑在幼苗葉片上，分別處理0、3、6和12 h，兩株幼苗為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，收取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)．

利用Trizol法提取玉米RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)24種NTP基因的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)引物(表1)分析處理不同時(shí)間后樣品中NTP基因表達(dá)量的變化．

2 結(jié)果與分析

2.1 植物NTP基因的進(jìn)化樹分析

通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹對擬南芥、水稻和玉米的NTP蛋白進(jìn)行分析(圖1)，在以上植物中都發(fā)現(xiàn)了NTP蛋白．?dāng)M南芥有10種NTP蛋白，其中，關(guān)于HESO1(AtNTP1)與URT1(AtNTP3)的研究較多．水稻與擬南芥NTP蛋白的種類數(shù)目較為接近，水稻有13種NTP蛋白，而玉米有24種NTP蛋白．通過進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)這3類植物中的NTP蛋白具有高度的同源性．例如，ZmNTP24、OsNTP3與擬南芥中已知的NTPAtHESO1在同一分支上，說明同源性很高，ZmNTP16、OsNTP10與AtURT1具有高度同源性．進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，玉米與水稻的NTP基因同源性更高，如ZmNTP7、ZmNTP11與OsNTP9，ZmNTP21與OsNTP4，ZmNTP1與OsNTP11、OsNTP12等．

表1 玉米NTP基因脅迫相關(guān)的啟動子元件分析

圖1 NTP進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of NTP

2.2 玉米中NTP基因的啟動子元件分析

為了研究玉米NTP基因與非生物脅迫之間的關(guān)系，通過生物信息分析軟件Plant CARE分析了玉米NTP基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500堿基對的啟動子序列．結(jié)果顯示，所有NTP基因都具有一個(gè)或者多個(gè)非生物響應(yīng)的相關(guān)元件(表1)．ZmNTP3、ZmNTP14、ZmNTP15、ZmNTP17、ZmNTP22和ZmNTP23含有3個(gè)或以上的ABA響應(yīng)元件； 24個(gè)NTP基因中有14個(gè)含有干旱應(yīng)答元件；絕大多數(shù)的NTP基因都含有厭氧誘導(dǎo)元件．以上結(jié)果說明，核苷酸轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因可能參與植物的非生物脅迫響應(yīng)．

2.3 NTP基因在鹽、干旱及植物激素ABA處理下的表達(dá)量分析

為驗(yàn)證玉米中核苷酸轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因啟動子元件分析的結(jié)果，對生長14 d的玉米幼苗進(jìn)行了干旱和高鹽(300 mmol/L)兩種非生物脅迫處理．此外，因?yàn)锳BA通路是植物應(yīng)對外界環(huán)境變化的重要通路之一，所以用ABA(100 μmol/L)溶液噴灑玉米幼苗葉片進(jìn)行脅迫處理．玉米的根分為胚根與節(jié)根，且根系相當(dāng)發(fā)達(dá)，根組織與地上部分組織應(yīng)對非生物脅迫的機(jī)制可能存在差異，所以將材料分為地上部分組織與根組織分別進(jìn)行研究．玉米NTP基因的RT-PCR分析結(jié)果說明，在干旱、高鹽和ABA處理下，核苷酸轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生了顯著的變化，部分核苷酸轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因能被誘導(dǎo)表達(dá)(圖2和圖3)．

ZmNTP22含有3個(gè)ABA順式作用元件，在根組織中，ZmNTP22在ABA處理6 h后，表達(dá)量明顯增多，在處理12 h后表達(dá)量達(dá)到最大，是對照的3.5倍左右(圖3)．值得注意的是，不同于根組織表達(dá)量的顯著增加，ZmNTP22在地上部分的表達(dá)水平只有對照組的1/10(圖2)，這說明ZmNTP22在不同的組織中應(yīng)答ABA脅迫的機(jī)制不同． 另外，ABA處理后，地上部分組織中(圖2)，ZmNTP2的表達(dá)量隨著處理時(shí)間而上升；ZmNTP19在ABA處理3 h后表達(dá)量達(dá)到最大，隨后下降．

ZmNTP9、ZmNTP17和ZmNTP23含有一個(gè)或以上的干旱應(yīng)答元件，RT-PCR分析結(jié)果顯示，受到干旱脅迫時(shí)，其表達(dá)量有顯著提升．ZmNTP9有3個(gè)干旱應(yīng)答元件，在受到干旱脅迫3 h后，其在根組織的表達(dá)量提升約3倍，隨后降至對照組水平(圖3)．ZmNTP17含有兩個(gè)干旱應(yīng)答元件，在受到干旱脅迫3 h后，其在根組織的表達(dá)量提高了4倍隨后恢復(fù)到對照水平(圖3)．ZmNTP23含有1個(gè)干旱應(yīng)答元件，在受到干旱脅迫3 h后，在地上部分組織中表達(dá)量上升了3.5倍(圖2)；根組織中，ZmNTP23表達(dá)量對比對照組，在3、6和12 h時(shí)均有顯著提升(圖3)．還有一些啟動子不含干旱應(yīng)答元件的NTP基因也明顯受干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)．例如，干旱脅迫后，ZmNTP24無論在地上部分或是根組織中的表達(dá)量均有顯著提升．在對比地上部分與根NTP基因表達(dá)差異時(shí)，發(fā)現(xiàn)在地上部分組織面對干旱脅迫時(shí)，ZmNTP1、ZmNTP5、ZmNTP6、ZmNTP9、ZmNTP10、ZmNTP11、ZmNTP12、ZmNTP16、ZmNTP17、ZmNTP18、ZmNTP19、ZmNTP20、ZmNTP21和ZmNTP22的表達(dá)量相比對照組均顯著降低，表達(dá)量明顯升高的僅有ZmNTP23和ZmNTP24；而在根組織中，受到干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)升高的NTP基因總數(shù)達(dá)到10種(ZmNTP2、ZmNTP3、ZmNTP4、ZmNTP8、ZmNTP9、ZmNTP17、ZmNTP20、ZmNTP22、ZmNTP23和ZmNTP24)． 說明玉米面對干旱脅迫時(shí)，其NTP基因可能主要在根組織中表達(dá)而非地上部分．

鹽脅迫是植物生長環(huán)境中主要威脅之一．在受到鹽脅迫后，地上部分組織中所有NTPs的表達(dá)量變化不大(圖2)．對比之下，在根組織中，ZmNTP4、ZmNTP8、ZmNTP9和ZmNTP22表達(dá)量有顯著提升(圖3)；ZmNTP4和ZmNTP22在受到鹽脅迫處理12 h后表達(dá)量升至1.5倍；在處理3 h時(shí)，ZmNTP8上升至1.5倍，ZmNTP9上升至3.5倍．此外，鹽脅迫下，根組織中ZmNTP2、ZmNTP3、ZmNTP7、ZmNTP11、ZmNTP13、ZmNTP15、ZmNTP19和ZmNTP21的表達(dá)量均有顯著下降(圖3)，而地上部分組織中僅有ZmNTP10和ZmNTP21表達(dá)量有明顯降低(圖2)．總的來說，在面對鹽脅迫時(shí)，地上部分僅有兩個(gè)NTP基因的表達(dá)發(fā)生明顯變化，而根組織中卻有12個(gè)NTP基因出現(xiàn)顯著性變化．這可能是因?yàn)橛衩譔TP基因面對不同非生物脅迫時(shí)有不同的響應(yīng)機(jī)制，面對鹽脅迫時(shí)NTP基因主要是通過根組織發(fā)揮作用．

圖2 非生物脅迫下玉米地上部分組織中NTP基因表達(dá)分析Fig.2 The relative expression of ZmNTPs-shoot under abiotic stress

圖3 在非生物脅迫下玉米根組織中NTP基因表達(dá)分析Fig.3 The relative expression of ZmNTPs-root under abiotic stress

3 討 論

通過對玉米中24種NTP基因分析研究，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，存在于擬南芥、水稻與玉米中的NTP蛋白具有高度的保守性與同源性．?dāng)M南芥中含10種NTP蛋白，水稻中含有13種，玉米中多達(dá)24種NTP蛋白，這可能是物種基因組的復(fù)雜與冗余程度遞增所致．植物中存在許多與脅迫相關(guān)基因，能通過改變這些基因的表達(dá)調(diào)控自身對于脅迫的耐受性． RT-PCR分析結(jié)果顯示玉米中NTP基因能夠在脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)，表明這些NTP蛋白參與了植物抵抗外界脅迫的途徑．這些NTP蛋白很有可能是通過對一些脅迫相關(guān)的RNA 3′端進(jìn)行修飾，從而改變植株對脅迫的抵抗能力．這些關(guān)鍵的RNA可能是mRNA、小RNA或是長鏈非編碼RNA．在對比玉米NTP蛋白在地上部分與根組織中表達(dá)差異時(shí)，結(jié)果表明，在面對不同類型脅迫時(shí)NTP基因表達(dá)有組織特異性，且在面對同一種脅迫時(shí)，NTP基因在地上部分組織與根組織中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制也是不同的．雖然研究表明玉米NTP基因可能參與了抵抗非生物脅迫的相關(guān)途徑，但相應(yīng)調(diào)控的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究．