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噬菌體在檢測(cè)食源性病原菌中的應(yīng)用研究進(jìn)展

2018-09-26 09:38:54朱方莉KhairyMorsyMOHAMED董星星王小紅李錦銓
食品科學(xué) 2018年17期
關(guān)鍵詞:噬菌體食源性沙門(mén)氏菌

魏 麟,朱方莉,周 洋,Khairy Morsy MOHAMED,袁 超,董星星,王小紅,李錦銓,,*

食源性疾病是人體攝入被污染的食品而引起感染或產(chǎn)生中毒性癥狀的疾病,可能由細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)、毒素等引起,其中細(xì)菌是導(dǎo)致食源性疾病的主要原因。常見(jiàn)的食源性致病菌有沙門(mén)氏菌(Salmonella)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria moncytogenes)、大腸桿菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)、志賀氏菌(Shigella)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),在發(fā)達(dá)國(guó)家,每年約有1/3的人群感染食源性疾病,全世界每年有220萬(wàn)~1 000萬(wàn) 人因患食源性疾病而喪生。美國(guó)食品工業(yè)中每年有約25%的食品由于被病原菌污染而損失[2]。為了降低食源性疾病的發(fā)生率和減輕由此造成的經(jīng)濟(jì)損失,世界衛(wèi)生組織正在推動(dòng)食品監(jiān)管體系建立的進(jìn)程,以保證從農(nóng)場(chǎng)到餐桌整條食品鏈上的食品安全[3]。在此背景下,尋找快速高效、準(zhǔn)確便捷的食源性病原菌檢測(cè)方法逐漸成為研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)。

目前,除了傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測(cè)方法、生理生化鑒定外,現(xiàn)代的食源性病原菌快速檢測(cè)方法還包括免疫學(xué)方法(如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、免疫擴(kuò)散法、膠體金技術(shù))、分子生物學(xué)方法(如實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)、多重PCR技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、基因芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等)、儀器分析方法(如質(zhì)譜法、流式細(xì)胞技術(shù)等)。上述方法在一定程度上縮短了檢測(cè)時(shí)間,提高了檢測(cè)效率,甚至能夠同時(shí)檢測(cè)多種病原菌。但已有的檢測(cè)方法也面臨著一些挑戰(zhàn),例如上述方法均不能有效區(qū)分死細(xì)菌、活細(xì)菌和處于存活非可培養(yǎng)(viable but nonculturable,VBNC)狀態(tài)的細(xì)菌,免疫學(xué)方法中存在抗體生產(chǎn)成本高、批次不穩(wěn)定等問(wèn)題,儀器分析法存在設(shè)備昂貴、樣品制備工作量大等問(wèn)題。

噬菌體不僅具備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、價(jià)格低廉等特性,而且具有能夠區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌的能力,并容易與其他傳統(tǒng)檢測(cè)方法相結(jié)合,因此,噬菌體在致病菌快速檢測(cè)方面的應(yīng)用被廣大學(xué)者和研究人員所重視[4],美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局宣布支持將一些噬菌體作為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法應(yīng)用到病原菌的檢測(cè)中[3]。一些發(fā)達(dá)國(guó)家也已出現(xiàn)具備商業(yè)化能力的噬菌體相關(guān)檢測(cè)產(chǎn)品,例如檢測(cè)領(lǐng)域的國(guó)際知名公司——法國(guó)生物梅里埃公司現(xiàn)已研發(fā)出利用重組噬菌體蛋白檢測(cè)食品和環(huán)境樣本中沙門(mén)氏菌的技術(shù),并取得國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Organization for Standardization,ISO)和美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(Association of Official Analytical Chemists,AOAC)的國(guó)際認(rèn)證。噬菌體及其產(chǎn)物應(yīng)用于食源性病原菌檢測(cè)方法具有良好的發(fā)展前景。本文就噬菌體在快速檢測(cè)食源性病原菌中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 噬菌體簡(jiǎn)介

細(xì)菌噬菌體是一類感染細(xì)菌的病毒,具有病毒的一般特性:個(gè)體微小、不具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu),只含有單一核酸;其特別之處是專以細(xì)菌為宿主,且通常具有特異性。凡是有細(xì)菌的地方,就可能有相應(yīng)的噬菌體存在。噬菌體主要由核酸和蛋白質(zhì)外殼組成,目前已知的絕大多數(shù)噬菌體為有尾部結(jié)構(gòu)的二十面體,其主要結(jié)構(gòu)可分為頭部、尾部與基部,二十面體的頭部中包裹著核酸,中空針狀結(jié)構(gòu)的尾部包括尾領(lǐng)、尾鞘與尾髓,基部由尾板、尾刺和尾絲組成,尾部和基部在噬菌體與細(xì)菌接觸的過(guò)程中起吸附等重要作用。

2 噬菌體在檢測(cè)食源性病原菌中的應(yīng)用

如今已有很多噬菌體快速檢測(cè)食源性致病菌的方法,這些檢測(cè)方法的原理涉及到噬菌體與細(xì)菌相互作用的全過(guò)程,有的建立在噬菌體與宿主細(xì)胞最初的識(shí)別與吸附過(guò)程上,另一些則依賴于侵染過(guò)程中噬菌體釋放核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞體內(nèi),如噬菌體基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá),或后代噬菌體裂解釋放到胞外[5]。

2.1 基于噬菌體的微生物學(xué)檢測(cè)方法

2.1.1 噬菌體用于細(xì)菌分型

噬菌體分型是一種常用的傳統(tǒng)細(xì)菌分型方法,用于區(qū)分細(xì)菌的不同亞型。噬菌體分型與常規(guī)生化實(shí)驗(yàn)法的檢出率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異,且可縮短時(shí)間[1]。早在20世紀(jì)60年代,用噬菌體對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行分型的方法就已被建立,研究人員首次用11 種噬菌體區(qū)分鑒別了12 種鼠傷寒沙門(mén)氏菌[5]。迄今為止,對(duì)于絕大多數(shù)較普遍的食源性病原菌如沙門(mén)氏菌、彎曲桿菌、大腸桿菌和李斯特菌等,噬菌體分型體系已經(jīng)較為成熟[6]。

研究表明,單獨(dú)使用某種方法分型難以達(dá)到很高的準(zhǔn)確度,而兩種或多種分型技術(shù)的聯(lián)合使用可使分型結(jié)果更加準(zhǔn)確[1]。因此,盡管近年來(lái)基于分子生物學(xué)發(fā)展起來(lái)的分子分型技術(shù)迅猛發(fā)展,但噬菌體分型因其分辨率高、廉價(jià)、快速等特點(diǎn)作為一種聯(lián)合分型方法仍然發(fā)揮著不可替代的重要作用。例如,在對(duì)O157:H7的分型進(jìn)行研究時(shí),研究人員指出,由于O157:H7的高度保守性,對(duì)該菌的流行病學(xué)研究必須采用不同的分型技術(shù),在不同分型方法比較的實(shí)驗(yàn)中,噬菌體分型技術(shù)能夠?qū)157:H7分成66 種詳細(xì)類別,分辨率高,是重要的分型方法之一[7]。

2.1.2 噬菌體用于鑒別細(xì)菌是否處于存活狀態(tài)

研究發(fā)現(xiàn),包括沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、大腸桿菌等重要食源性病原菌在內(nèi)的60多種細(xì)菌,在物理因素(溫度、濕度、氧氣含量、光照強(qiáng)度等)、化學(xué)因素(營(yíng)養(yǎng)成分、有害化學(xué)物質(zhì)等)及生物因素的誘導(dǎo)作用下,會(huì)進(jìn)入VBNC狀態(tài)[8]。當(dāng)細(xì)菌處于VBNC狀態(tài)時(shí),其仍具有代謝活性并保持著致病的潛力,在適宜的環(huán)境中即可恢復(fù)。但是傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法或生化方法無(wú)法檢測(cè)出該種狀態(tài)細(xì)菌的存在,分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法和儀器分析也很難將其與已經(jīng)死亡的無(wú)害細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分,這對(duì)傳統(tǒng)的微生態(tài)學(xué)和食品安全提出了新的挑戰(zhàn)。而噬菌體只與活細(xì)胞識(shí)別、結(jié)合的選擇特異性將出現(xiàn)假陽(yáng)性與假陰性結(jié)果的可能性降到了最小[3]。

Fernandes等[3]對(duì)比了抗體與噬菌體在識(shí)別不同生理狀態(tài)細(xì)胞方面的差異,不同樣品中混有不同比例的VBNC狀態(tài)和死亡細(xì)胞(包括熱力殺死的細(xì)胞),抗體不加識(shí)別地結(jié)合捕獲了處于不同生理狀態(tài)下的所有細(xì)菌而造成假陽(yáng)性現(xiàn)象,噬菌體則能夠有效區(qū)分不同生理狀態(tài)的細(xì)胞。

2.1.3 噬菌體擴(kuò)增法

烈性噬菌體感染宿主菌后短時(shí)間內(nèi)會(huì)引起細(xì)胞的裂解而在雙層平板中形成明顯的噬菌斑[1],細(xì)胞裂解、后代噬菌體釋放,即標(biāo)志著特異性宿主細(xì)胞的存在[5];因此根據(jù)噬菌斑的數(shù)目可以檢測(cè)樣品中病原菌的含量。噬菌體擴(kuò)增法簡(jiǎn)單、成本較低[1],其顯著優(yōu)點(diǎn)是不需要基因工程或化學(xué)修飾等復(fù)雜技術(shù)[5],因此得以在一些規(guī)模較小的食品加工廠推廣應(yīng)用[9]。Stewart等[10]使用Felix O-1噬菌體檢測(cè)沙門(mén)氏菌,用NCIMB 10116和NCIMB 10884噬菌體檢測(cè)銅綠假單胞菌,在純培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,檢測(cè)時(shí)間為4 h,檢測(cè)限分別為600 CFU/mL和40 CFU/mL。此外,Rees[11-12]、Siqueira[13]等采用噬菌體擴(kuò)增法已成功地檢測(cè)出結(jié)核桿菌、沙門(mén)氏菌、李斯特菌、大腸桿菌、綠膿假單胞菌和彎曲桿菌等。

噬菌體擴(kuò)增法還可與光密度法結(jié)合,光密度值的減小表示信號(hào)放大細(xì)胞由于被噬菌體感染而裂解,總數(shù)下降;光密度值增大則表示信號(hào)放大細(xì)胞沒(méi)有被噬菌體感染,自身生長(zhǎng)繁殖而總數(shù)上升。這種方法已經(jīng)成功被應(yīng)用于檢測(cè)人工染菌的脫脂奶粉、雞肉和碎牛肉中,平均檢測(cè)限為3 CFU/g或3 CFU/mL,總檢測(cè)時(shí)間為20 h(包括前增菌時(shí)間)[14]。

基于噬菌體的微生物學(xué)檢測(cè)方法的缺點(diǎn)在于其對(duì)噬菌體總量、感染時(shí)間等條件有一定要求,且微生物學(xué)檢測(cè)方法通常耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng),對(duì)操作人員的操作技術(shù)要求高。

近年來(lái),噬菌體與免疫學(xué)、分子生物學(xué)和納米科學(xué)等其他方法的聯(lián)合使用推動(dòng)了基于噬菌體的食源性病原菌快速檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展,催生了一系列操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、靈敏度高的檢測(cè)方法,下文將進(jìn)行分述。

2.2 噬菌體與分子生物學(xué)方法結(jié)合(報(bào)告噬菌體法)

報(bào)告噬菌體是經(jīng)過(guò)基因工程方法改造過(guò)的噬菌體,內(nèi)含能夠編碼介導(dǎo)熒光發(fā)色的基因/基因簇[15],或含有其他由噬菌體特異性編碼的可表達(dá)被檢測(cè)標(biāo)記物的基因,在識(shí)別特異性宿主細(xì)胞(目標(biāo)菌)后,噬菌體侵染細(xì)胞并將其DNA注射進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)[16],隨著報(bào)告基因的表達(dá),目標(biāo)菌體便可快速得到檢測(cè)。

2.2.1 gfp基因

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,gfp)是一種生物發(fā)光蛋白,其內(nèi)源熒光基因在受到紫外光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)可高效發(fā)射出清晰可見(jiàn)的綠光[1],gfp基因的優(yōu)勢(shì)是無(wú)需再加任何底物和輔助因子即可構(gòu)成熒光檢測(cè)系統(tǒng)。

Tanji等[17]用T4噬菌體構(gòu)建了一個(gè)大腸桿菌gfp報(bào)告噬菌體,T4噬菌體具有裂解性,其優(yōu)點(diǎn)是目標(biāo)病原菌在被檢測(cè)到的同時(shí)可被殺死,缺點(diǎn)在于熒光基因表達(dá)后細(xì)菌裂解,這不利于待測(cè)產(chǎn)物熒光的檢測(cè)。因此,研究人員改造出了一種不裂解細(xì)菌的T4e-/gfp噬菌體,并成功用于大腸桿菌的檢測(cè),檢測(cè)時(shí)間縮短至1 h。Miyanaga等[18]也成功應(yīng)用T4e-/gfp噬菌體檢測(cè)出了污水中的大腸桿菌K12。相似地,Oda等[19]應(yīng)用gfp標(biāo)記T2類噬菌體,構(gòu)建重組噬菌體PP01/gfp檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7,該法能夠檢測(cè)到處于VBNC狀態(tài)下的大腸桿菌。

2.2.2 熒光素酶基因(lux和luc)

噬菌體自身無(wú)法合成發(fā)光反應(yīng)所必需的熒光素酶、底物和能量,因此在細(xì)胞外不發(fā)光,當(dāng)其侵染宿主細(xì)菌后,發(fā)光基因表達(dá),細(xì)菌代謝活動(dòng)可產(chǎn)生發(fā)光反應(yīng)所必需的物質(zhì),噬菌體便在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)光[1]。lux基因操縱子包括luxCDE和luxAB,luxCDE負(fù)責(zé)編碼脂肪酸還原酶體系(還原酶、合成酶和轉(zhuǎn)移酶),用于促進(jìn)作為反應(yīng)底物的脂肪醇的生物合成。luxAB則編碼熒光素酶α和β亞基,與底物一起用于發(fā)光反應(yīng)[20]。因此,單獨(dú)使用luxAB需要添加額外的物質(zhì)如癸醛作為輔助[5],使用復(fù)合的luxCDABE則無(wú)需添加。

Ripp[5]利用能夠感染近95%李斯特菌血清型的A511噬菌體構(gòu)建了luxAB報(bào)告噬菌體,用于檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌。也有研究人員在鼠傷寒沙門(mén)氏菌P22噬菌體中引入luxAB基因,于16 h內(nèi)檢測(cè)出樣品中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌[1]。Ripp[5]進(jìn)一步在luxAB的基礎(chǔ)上首次構(gòu)建了luxCDABE報(bào)告噬菌體。隨后,在此基礎(chǔ)上,一種新的鼠傷寒沙門(mén)氏菌報(bào)告噬菌體SPC32H-CDABE被成功構(gòu)建,并用于檢測(cè)食物樣品中的沙門(mén)氏菌,其在卷心萵苣、豬肉和牛奶中的檢測(cè)限分別為22、37 CFU/g和700 CFU/g[21]。

luc可編碼真核生物熒光素酶,該酶可以催化D-熒光素氧化成氧化熒光素,氧化過(guò)程中會(huì)發(fā)出生物熒光,并可在560 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)到。luc與luxAB的使用類似,也需要添加額外的輔助物質(zhì)[5]。Bardarov等[22]使用luc報(bào)告噬菌體phAE142檢測(cè)唾液樣品中的結(jié)合分歧桿菌,檢測(cè)時(shí)間為7 d,與傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)分歧桿菌生長(zhǎng)指示管法相比縮短了檢測(cè)時(shí)間,但缺點(diǎn)在于其檢測(cè)限高于傳統(tǒng)方法。

2.2.3 lacZ基因

β-半乳糖苷酶基因(lacZ)編碼β-半乳糖苷酶,該酶可催化β-半乳糖苷的水解反應(yīng),常作為報(bào)告基因分子與熒光素酶聯(lián)用[1],或作為化學(xué)發(fā)光底物。Goodridge[23]利用lacZ報(bào)告噬菌體成功檢測(cè)出樣品中的O157:H7,檢測(cè)限為102CFU/mL。與gfp、lux和luc相比,lacZ報(bào)告噬菌體使用較少[3]。

2.2.4 inaW基因

冰核蛋白基因(inaW)能夠使沒(méi)有成冰核能力的細(xì)菌具有成冰核能力,其與通常的報(bào)告基因不同之處在于它所介導(dǎo)的是一種物理過(guò)程,即水的液-固狀態(tài)的改變[1]。Pawlowska等[24]將其與免疫磁珠分離法聯(lián)用檢測(cè)樣品中的沙門(mén)氏菌,將檢出限降低到5 CFU/mL。

2.2.5 堿性磷酸酶

將編碼堿性磷酸酶的基因通過(guò)基因工程方法導(dǎo)入噬菌體基因組中,噬菌體侵染合適的宿主菌,在宿主菌體內(nèi)表達(dá)該基因產(chǎn)生堿性磷酸酶,細(xì)菌裂解后堿性磷酸酶釋放,通過(guò)檢測(cè)該特殊蛋白質(zhì)即可完成對(duì)宿主菌的檢測(cè)。將噬菌體特異性編碼的堿性磷酸酶作為檢測(cè)標(biāo)記物,與將細(xì)菌裂解后產(chǎn)生的自身的內(nèi)容物作為待測(cè)物質(zhì)相比,該方法有效地避免了由于細(xì)菌自然裂解而產(chǎn)生的檢測(cè)誤差,從而大大提高了準(zhǔn)確度。Neufeld等[25]使用該方法在3 h內(nèi)檢測(cè)到了單個(gè)的大腸桿菌。

報(bào)告噬菌體法用時(shí)短、耗能少、準(zhǔn)確性較好,隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷進(jìn)步與革新,有很好的應(yīng)用前景,但由于噬菌體的專一性,該類方法無(wú)法同時(shí)檢測(cè)一個(gè)細(xì)菌中的多種血清型[1]。

2.3 噬菌體與免疫學(xué)方法結(jié)合

免疫學(xué)方法是依據(jù)抗原與抗體特異性反應(yīng)的檢測(cè)方法,如常見(jiàn)的酶聯(lián)免疫吸附法。免疫學(xué)方法的核心是抗體和抗原的互作反應(yīng),而抗體的生產(chǎn)存在批次之間不穩(wěn)定、分子質(zhì)量大、保存條件要求高、純化成本高、交叉反應(yīng)和動(dòng)物福利等問(wèn)題,采用噬菌體及其結(jié)構(gòu)成分替代抗體可以有效解決以上問(wèn)題,極大地降低了檢測(cè)成本。法國(guó)生物梅里埃公司已經(jīng)利用噬菌體重組蛋白替代抗體,研發(fā)出用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的商業(yè)化產(chǎn)品,且將檢測(cè)時(shí)間由原來(lái)的3 d縮短至19 h[26]。

Stambach等[27]以免疫層析法為基礎(chǔ),使用A511噬菌體代替原有第一抗體,結(jié)合拉曼活性染料,構(gòu)建了SERS-LFI(surface enhanced Raman spectroscopy-lateral flow immunochromatography)法對(duì)李斯特菌進(jìn)行檢測(cè),將檢測(cè)時(shí)間由原來(lái)的8 h縮短至2 h。此外,研究人員指出,傳統(tǒng)的噬菌體空斑檢測(cè)方法需要長(zhǎng)達(dá)24 h的時(shí)間,而SERS-LFI法有望將檢測(cè)時(shí)間縮短到30 min。

近年來(lái)對(duì)噬菌體的研究表明,噬菌體的結(jié)構(gòu)成分尾絲蛋白(tailspike proteins,TSP)對(duì)宿主細(xì)菌也具有高親和性。Schmidt等[28]使用沙門(mén)氏菌噬菌體9NA和噬菌體P22的TSP替代抗體,構(gòu)建ELITA(enzyme linked immunosorbent assay like tailspike adsorption)方法,對(duì)44 種沙門(mén)氏菌菌株進(jìn)行分析,并成功將血清型為O1的菌株從非葡萄糖基化菌株中區(qū)分離出來(lái)。同時(shí),噬菌體細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)域(cell wall binding domain,CBD)也具有應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的潛在價(jià)值[29]。噬菌體結(jié)構(gòu)成分TSP、CBD等親和性、操作性強(qiáng),生產(chǎn)應(yīng)用簡(jiǎn)便,與傳統(tǒng)免疫學(xué)方法結(jié)合使用具有很好的應(yīng)用前景。

2.4 噬菌體與發(fā)光試劑聯(lián)用

2.4.1 生物發(fā)光法

2.4.1.1 ATP生物發(fā)光法

ATP能夠在真核生物luc基因編碼的螢火蟲(chóng)熒光素酶的作用下發(fā)光。利用噬菌體裂解細(xì)菌釋放出胞內(nèi)物質(zhì)ATP,使用熒光素酶使ATP釋放出能量,其產(chǎn)生熒光的強(qiáng)度與ATP含量成正比,據(jù)此可推斷出菌落總數(shù)[1]。Miyanaga等[18]根據(jù)腺苷酸激酶(adenylate kinase,AK)可催化ADP轉(zhuǎn)化成ATP的原理將此法改進(jìn),噬菌體裂解細(xì)菌后釋放出來(lái)的AK將加入樣品中的ADP轉(zhuǎn)化成ATP,提高了樣品的發(fā)光強(qiáng)度,能夠在1 h之內(nèi)檢測(cè)出低于103CFU/mL的大腸桿菌。

2.4.1.2 NADH生物發(fā)光法

特定代謝時(shí)期的微生物細(xì)胞中的NADH(nicotinamide adenine dinucleotide)含量相對(duì)穩(wěn)定,且其含量與食品中微生物的數(shù)量成正相關(guān)。細(xì)菌死亡后,NADH則在胞內(nèi)酶作用下被分解。利用烈性噬菌體裂解宿主細(xì)菌,釋放出胞內(nèi)的NADH,其在氧化還原酶和熒光素酶作用下發(fā)光,通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度即可推算出菌落總數(shù)[1]。Roach等[30]利用噬菌體介導(dǎo)的NADH生物發(fā)光法成功檢測(cè)出克雷伯氏菌。

生物發(fā)光法操作簡(jiǎn)便、靈敏度較高,也可用于食品生產(chǎn)設(shè)備及環(huán)境中的病原微生物檢測(cè)。美國(guó)Sample6公司已研發(fā)出一種基于噬菌體和生物熒光素酶結(jié)合的檢測(cè)系統(tǒng)[31],即使是極少量細(xì)菌的存在也可被該系統(tǒng)檢測(cè)。

2.4.2 化學(xué)發(fā)光試劑(熒光標(biāo)記噬菌體法)

一些化學(xué)發(fā)光試劑可通過(guò)化學(xué)共價(jià)結(jié)合或物理吸附到細(xì)胞的某些基團(tuán)上,從而表現(xiàn)其發(fā)光特性,檢測(cè)宿主菌。隨著科技的發(fā)展,YOYO-1、SYBR、SYTO等商業(yè)化熒光試劑逐步被開(kāi)發(fā)出來(lái)[1],由于其與核酸的高親和性,該類熒光試劑在一定程度上取代了傳統(tǒng)的熒光染料。Goodridge[23]使用YOYO-1熒光標(biāo)記的LG1噬菌體檢測(cè)碎牛肉和牛奶中的大腸桿菌O157:H7,檢測(cè)時(shí)間分別為12 h和7 h,檢測(cè)限為100 CFU/mL。Mosier-Boss等[32]成功使用SYBR gold染料標(biāo)記P22噬菌體以檢測(cè)沙門(mén)氏菌。

2.4.3 物理發(fā)光(量子點(diǎn))

納米微粒半導(dǎo)體量子點(diǎn)是一種具有較高發(fā)光效率、巰基羧酸修飾的納米微粒熒光探針,其具有很高的量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性[5],CdSe、CdTe等半導(dǎo)體量子點(diǎn)已成為科學(xué)界的研究熱點(diǎn)[1]。

Edgar等[33]利用量子點(diǎn)與T7噬菌體結(jié)合檢測(cè)大腸桿菌,其原理是通過(guò)改造噬菌體的衣殼蛋白,使其具有一段生物素?;碾亩危删w侵染宿主菌后,在宿主菌內(nèi)合成的后代噬菌體就成為被生物素?;氖删w,鏈霉親和素功能化的量子點(diǎn)只結(jié)合并標(biāo)記被生物素?;氖删w[5]。使用該法檢測(cè)河水樣品中的大腸桿菌,檢測(cè)時(shí)間為1 h,可檢測(cè)到20 CFU/mL大腸桿菌。

然而,因?yàn)門(mén)7噬菌體對(duì)宿主菌持續(xù)的裂解使得噬菌體-細(xì)胞結(jié)合物的定量分析復(fù)雜化(目標(biāo)細(xì)胞減少而碎片增多),量子點(diǎn)與噬菌體結(jié)合率低,且阻礙后續(xù)檢測(cè)中量子點(diǎn)噬菌體與細(xì)菌細(xì)胞的相互作用,其應(yīng)用方法還有待改進(jìn)[34]。Yim等[34]使用改造過(guò)的溫和型Lambda噬菌體規(guī)避了這些問(wèn)題,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Lambda噬菌體結(jié)合的平均量子點(diǎn)數(shù)量多于T7噬菌體。

2.5 噬菌體與傳感器聯(lián)用

生物傳感器通常含有一種生物感應(yīng)成分,如抗體、酶或受體配對(duì)成分。這類生物樣成分被結(jié)合到一個(gè)理想的傳感器上,傳感器可以將不同的生物信號(hào),如光信號(hào)、電化學(xué)信號(hào)、熱信號(hào)等轉(zhuǎn)換成可測(cè)量的數(shù)碼讀數(shù)。

2.5.1 電化學(xué)原理傳感器

電化學(xué)原理傳感器將待檢測(cè)物質(zhì)與生物活性材料發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào),由換能器轉(zhuǎn)換成可定量處理的電信號(hào)等其他信號(hào),經(jīng)二次儀表放大輸出,獲得待檢物數(shù)量的信息[1]。

2.5.1.1 以噬菌體與宿主細(xì)胞吸附、互作過(guò)程為基礎(chǔ)的檢測(cè)

噬菌體對(duì)宿主細(xì)胞吸附、侵染的過(guò)程往往會(huì)產(chǎn)生電信號(hào)的變化,通過(guò)構(gòu)建合適的電化學(xué)原理傳感器以監(jiān)測(cè)不同形式電信號(hào)的變化,經(jīng)過(guò)一定的信號(hào)轉(zhuǎn)換和定量計(jì)算,即可完成對(duì)目標(biāo)菌的檢測(cè)。主要包括以下幾類:1)離子級(jí)聯(lián)反應(yīng)。噬菌體觸發(fā)的離子級(jí)聯(lián)反應(yīng)使用電化學(xué)方法檢測(cè)噬菌體與宿主菌吸附后的微小電壓波動(dòng),噬菌體吸附后將其核酸注入宿主菌,宿主菌立刻釋放近108數(shù)量級(jí)的離子到周圍的環(huán)境介質(zhì)中,其離子通量可以通過(guò)兩個(gè)金屬薄膜微電極檢測(cè)[5]。Dobozi-King等[35]以大腸桿菌作為目標(biāo)檢測(cè)菌,構(gòu)建了一個(gè)nanowell鈦電極電容器檢測(cè)離子通量,并提出該方法具有靈敏度達(dá)到1 cell/μL的潛力。2)電化學(xué)發(fā)光生物傳感器(electrochemiluminescent biosensor,ECL)。PaP1噬菌體是從醫(yī)院污水中分離出來(lái)的一種烈性噬菌體,它對(duì)綠膿假單胞菌具有很強(qiáng)的吸附性和特異性,Yue Huan等[36]將分離出來(lái)的PaP1噬菌體與羧基石墨烯結(jié)合,并電鍍到玻碳電極上,構(gòu)建出了一種新的ECL(圖1)。當(dāng)噬菌體特異性吸附綠膿假單胞菌時(shí),由于形成的絕緣生物復(fù)合物阻礙了表面電子轉(zhuǎn)移和ECL活性分子的光散射,ECL光信號(hào)下降。當(dāng)綠膿假單胞菌總數(shù)在1.4×102~1.4×106CFU/mL范圍時(shí),ECL發(fā)射光信號(hào)隨其數(shù)量上升而線性下降,檢測(cè)限僅為56 CFU/mL,整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需30 min[36]。3)表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)。SPR檢測(cè)病原菌的原理是通過(guò)檢測(cè)由抗體與病原菌的特異性結(jié)合導(dǎo)致的折射率變化,從而得出病原菌的數(shù)量[5]。與抗體相比,噬菌體同樣具有與病原菌特異性結(jié)合的能力,且通常靈敏度更高,成本更低。Balasubramanian等[37]將SPR法與噬菌體結(jié)合,通過(guò)檢測(cè)噬菌體與金黃色葡萄球菌特異性結(jié)合導(dǎo)致的折射率變化,完成了對(duì)金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè),檢測(cè)限為104mL-1。雖然SPR儀器比較昂貴,但是有望研發(fā)成為一種高通量的檢測(cè)技術(shù)。

圖1 ECL示意圖[5,36]Fig. 1 Schematic illustration of ECL[5,36]

2.5.1.2 以噬菌體裂解宿主細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)溶物為基礎(chǔ)的檢測(cè)

內(nèi)溶物變化導(dǎo)致阻抗變化。細(xì)菌在培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程中,大分子電惰性物質(zhì)(碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類等)轉(zhuǎn)化成具有電活性的小分子物質(zhì)(乳酸鹽、醋酸鹽等),這些離子態(tài)物質(zhì)能增加培養(yǎng)基的導(dǎo)電性,使培養(yǎng)基的阻抗發(fā)生變化[1];因此可以通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基的阻抗變化情況來(lái)判定細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖特性。Chang等[38]利用此法,將專一性噬菌體AR1作用于E. coil O157:H7,根據(jù)阻抗變化時(shí)間成功檢測(cè)出大腸桿菌。

內(nèi)溶物與外加底物發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生信號(hào)變化。Lambda噬菌體侵染大腸桿菌后,最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞裂解,釋放出β-半乳糖苷酶,β-半乳糖苷酶可作用于外加底物對(duì)氨基苯-β-D-半乳吡喃糖苷,并在碳陽(yáng)極產(chǎn)生氧化產(chǎn)物對(duì)氨基苯酚,通過(guò)安培計(jì)檢測(cè)電流變化[5]。Yemini等[39]使用類似方法,通過(guò)噬菌體B1-7064引發(fā)細(xì)胞釋放α-葡萄糖苷酶,從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)蠟狀芽孢桿菌的檢測(cè)。

2.5.2 磁傳感器

一些軟磁鐵非晶態(tài)合金可參與構(gòu)建靈敏的磁傳感器,用于食源性病原菌的檢測(cè)[40]。Lakshmanan等[41]使用磁性傳感器與絲狀噬菌體結(jié)合檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌,其原理是任何非磁彈性的物質(zhì)接觸傳感器表面,就會(huì)抑制機(jī)械振蕩,從而引起共振頻率降低(圖2)。使用絲狀噬菌體作為生物探針,與磁傳感器結(jié)合(物理吸附),然后暴露于數(shù)量范圍在5×10~5×108CFU/mL的鼠傷寒沙門(mén)式菌中,當(dāng)鼠傷寒沙門(mén)氏菌特異性結(jié)合噬菌體時(shí),通過(guò)磁場(chǎng)變化引起電信號(hào)轉(zhuǎn)變,最終導(dǎo)致共振頻率的改變,而共振頻率與結(jié)合菌的數(shù)量有關(guān)。

圖2 磁傳感器示意圖[41-42]Fig. 2 Schematic illustration of magnetoelastic sensors[41-42]

Chen等[42]采用與上述方法類似的原理,使用噬菌體C4-22與磁傳感器結(jié)合,檢測(cè)雞胸肉樣品中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌,除了檢測(cè)雞胸肉表面的帶菌情況,他們還將磁傳感器放置在雞肉內(nèi)部,即距離表面分別為0.1、0.5 cm和1.0 cm的位置進(jìn)行檢測(cè),這也是第一個(gè)使用傳感器直接檢測(cè)雞肉表面和內(nèi)部病原菌污染的成功實(shí)例[42]。結(jié)果表明,使用噬菌體C4-22與普通對(duì)照組(無(wú)噬菌體)相比,其與沙門(mén)氏菌的結(jié)合親和度提高了12 倍,且在雞肉表面樣品中的檢測(cè)限僅為7.86×103CFU/mm2。

與傳感器聯(lián)用的噬菌體檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)單、分析速度快,可發(fā)展為便攜式檢測(cè)設(shè)備,但其抗干擾能力有待提高。

2.6 噬菌體與質(zhì)譜法聯(lián)用

Davesiakwei等[43]將噬菌體與質(zhì)譜法結(jié)合檢測(cè)食品樣品中的大腸桿菌,其原理為T(mén)7噬菌體可專一感染大腸桿菌,并在1~2 h后擴(kuò)增100 倍,后用液相色譜-多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)串聯(lián)質(zhì)譜法定量檢測(cè)專一性噬菌體肽段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肉湯培養(yǎng)基、椰子水和蘋(píng)果汁中的檢測(cè)限分別為3.0×103、4.1×104、1.9×103CFU/mL。相似地,Madonna等[44]使用基質(zhì)輔助激光/電離質(zhì)譜法通過(guò)檢測(cè)噬菌體衣殼蛋白的分子質(zhì)量從而定量檢測(cè)大腸桿菌,檢測(cè)限為104CFU/mL,檢測(cè)時(shí)間為2 h。Martelet等[45]則進(jìn)一步把噬菌體擴(kuò)增與免疫磁珠分離法結(jié)合,用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合檢測(cè)噬菌體標(biāo)記蛋白,完成對(duì)大腸桿菌的定量檢測(cè)。以上結(jié)果表明噬菌體與質(zhì)譜法聯(lián)用不僅可以對(duì)大腸桿菌進(jìn)行定量檢測(cè),而且能夠提高檢測(cè)靈敏度。

除噬菌體的整體應(yīng)用外,噬菌體的某些結(jié)構(gòu)成分或受體結(jié)合蛋白也可單獨(dú)使用,由于其對(duì)細(xì)菌具有特殊的親和力,且易于操作,因而被廣泛應(yīng)用于病原菌的快速檢測(cè)中,如TSP和噬菌體CBD等。其中已有一些技術(shù)開(kāi)始逐步邁向商業(yè)化,如法國(guó)生物梅里埃公司利用噬菌體重組蛋白開(kāi)發(fā)出的用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的Vidas?up重組噬菌體技術(shù)已獲得國(guó)際認(rèn)證;Schmelcher等[46]研發(fā)出的由不同血清型李斯特菌噬菌體編碼的CBD和熒光蛋白組成的綜合性分型試劑盒,可同時(shí)區(qū)分和檢測(cè)多種血清型的李斯特菌。下文以CBD為代表展開(kāi)論述。

3 噬菌體CBD在檢測(cè)食源性病原菌中的應(yīng)用

3.1 CBD簡(jiǎn)介

噬菌體能夠編碼一種細(xì)胞內(nèi)溶素,其本質(zhì)是肽聚糖水解酶,該酶包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,肽聚糖水解酶活性區(qū)域也稱N端裂解區(qū)域,CBD也稱C端結(jié)合區(qū)域[47-48],前者決定了內(nèi)溶素酶對(duì)宿主的裂解活性,后者則負(fù)責(zé)結(jié)合宿主細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)。其中CBD具有與宿主以高度特異性、親和性結(jié)合的特點(diǎn)以及易于修飾的特性,因此其在病原菌快速檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用成為了新的焦點(diǎn),甚至比全噬菌體的應(yīng)用得到了更為廣泛的關(guān)注[49]。

3.2 CBD與免疫磁珠法結(jié)合用于固定分離、富集待測(cè)菌

抗體-免疫磁珠法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原菌快速檢測(cè)中的分離、富集過(guò)程,但是抗體由于其成本、批次穩(wěn)定性等問(wèn)題還存在一定的改善空間。而CBD與特定細(xì)菌的結(jié)合具有很高的親和性和特異性[20],且CBD比抗體的體積小很多;研究表明,1 個(gè)細(xì)胞表面至少有107數(shù)量級(jí)的CBD結(jié)合位點(diǎn)[50],同時(shí),CBD來(lái)源于噬菌體,成本較低。CBD所具有的這些特性使其成為快速檢測(cè)病原菌方法中抗體的理想替代品[20,51]。

已有許多研究人員將CBD與免疫磁珠法結(jié)合完成了對(duì)病原菌的高效富集。Yu Junping等[50]提出細(xì)胞內(nèi)溶素plyV12可通過(guò)免疫磁珠分離方法用來(lái)富集宿主細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用CBD和磁珠組合物進(jìn)行富集,可以檢測(cè)到牛奶樣品中的金黃色葡萄球菌,檢測(cè)限為400 CFU/mL,檢測(cè)時(shí)間僅為1.5 h。Schmelcher等[46]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)CBD能夠特異性識(shí)別李斯特菌細(xì)胞壁肽聚糖上特有的碳水化合物組分,且具有很高的結(jié)合活性和親和力。在此基礎(chǔ)上,Kretzer等[29]證明了特定噬菌體編碼的CBD能夠分別識(shí)別其對(duì)應(yīng)宿主蠟狀芽孢桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌,從而推得CBD免疫磁珠方法的普遍適用性。

3.3 CBD與熒光蛋白結(jié)合用于分型

熒光蛋白標(biāo)記的CBD可用于分型、檢測(cè)多種特定的食源性病原菌[46]。Kretzer等[29]將構(gòu)建CBD-GFP的重組蛋白成功用于李斯特菌的檢測(cè)。

若用不同顏色的熒光蛋白對(duì)CBD進(jìn)行標(biāo)記,構(gòu)建一種雞尾酒CBD檢測(cè)工具,則可同時(shí)識(shí)別食物樣品中的多種病原菌[20]。例如,Schmelcher等[46]研制了一種由不同血清型李斯特菌噬菌體編碼的CBD和熒光蛋白組成的綜合性分型試劑盒。他們首先建立了一個(gè)分類系統(tǒng),將來(lái)源于所有已知的李斯特菌噬菌體產(chǎn)生的內(nèi)溶素酶CBD分類,并且根據(jù)CBD的結(jié)構(gòu)特性、結(jié)合特異性與親和性篩選出每一類中最具代表性的CBD,然后用不同熒光蛋白標(biāo)記,構(gòu)建成為報(bào)告CBD,并用該綜合試劑盒在牛奶和奶酪等食物樣品中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),分別用紅星(RedStar)和GFP標(biāo)記的CBD-P35和CBD500成功實(shí)現(xiàn)了同時(shí)區(qū)分和檢測(cè)多種血清型的李斯特菌。

3.4 CBD與其他方法結(jié)合用于檢測(cè)病原菌的實(shí)例

3.4.1 CBD-SPR

Kong等[52]將宿主為蠟狀芽孢桿菌的噬菌體產(chǎn)生的CBD與SPR檢測(cè)方法結(jié)合,這種CBD改良的SPR芯片可用于檢測(cè)數(shù)量范圍在105~108CFU/mL的蠟狀芽孢桿菌(圖3)。在熟米飯樣品中,103CFU/mL的蠟狀芽孢桿菌被檢出。此外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)CBD修飾的芯片所介導(dǎo)的SPR反應(yīng)強(qiáng)度是抗體修飾的芯片的兩倍,表明CBD與宿主結(jié)合特性強(qiáng)于抗體。這也是第一個(gè)用SPR與CBD結(jié)合檢測(cè)蠟狀芽孢桿菌成功的實(shí)例[52]。

圖3 CBD與SPR結(jié)合檢測(cè)方法示意圖[6,52]Fig. 3 Schematic illustration for the detection method using a CBD-modifed SPR chip[6,52]

3.4.2 CBD-電化學(xué)

Tolba等[48]將李斯特菌噬菌體產(chǎn)生的內(nèi)溶素酶與電化學(xué)檢測(cè)方法相結(jié)合,CBD與李斯特菌細(xì)胞的特異性吸附導(dǎo)致了電子轉(zhuǎn)移電阻的顯著變化,當(dāng)細(xì)胞數(shù)量范圍在104~108CFU/mL時(shí),電子轉(zhuǎn)移電阻與細(xì)胞數(shù)量呈線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證明在純培養(yǎng)液和牛奶樣品中,李斯特菌的檢測(cè)限分別為1.1×104、1.1×105CFU/mL。

4 基于噬菌體的食源性病原菌商業(yè)化檢測(cè)方法

食源性病原菌的檢測(cè)涉及從食品原料到成品的每一個(gè)環(huán)節(jié),無(wú)論是大型食品企業(yè)還是小型食品工廠或是專門(mén)檢測(cè)機(jī)構(gòu),在引進(jìn)一種新的檢測(cè)技術(shù)或設(shè)備時(shí)必然要考慮其安全性能、準(zhǔn)確程度、經(jīng)濟(jì)成本、時(shí)間成本以及對(duì)于技術(shù)人員的操作要求等因素。因此,這就需要針對(duì)食源性病原菌的快速檢測(cè)技術(shù)不斷完善,逐步邁向商業(yè)化的道路。

目前,一些基于噬菌體檢測(cè)的方法已經(jīng)較為成熟,國(guó)外已有進(jìn)入研發(fā)實(shí)驗(yàn)階段甚至投入市場(chǎng)推廣應(yīng)用的先例。例如,法國(guó)生物梅里埃公司開(kāi)發(fā)出一種Vidas?up重組噬菌體技術(shù)用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌,利用噬菌體重組蛋白替代抗體,大大提高了檢測(cè)靈敏度,將檢測(cè)時(shí)間縮短至19 h,而現(xiàn)有其他參考方法往往需要3 d,并可驗(yàn)證375 g的樣品,該技術(shù)目前已得到ISO(AFNOR BIO-12/32-10/11)和AOAC(Official Method 2013.01)的權(quán)威認(rèn)證。

美國(guó)Sample6公司已研發(fā)出一種基于噬菌體和熒光素酶結(jié)合的檢測(cè)系統(tǒng)[31],為了達(dá)到更好的靈敏度,該公司修飾了由噬菌體注入病原菌的生物熒光酶,使得即使只有極少數(shù)細(xì)菌存在也能產(chǎn)生很亮的熒光,且該方法可僅檢測(cè)活細(xì)胞。該檢測(cè)系統(tǒng)稱為生物發(fā)光平臺(tái),工廠工人只需使用取樣裝置(如海綿或棉簽)擦拭一下樣品,然后將樣液經(jīng)過(guò)處理、離心,并與熒光素酶混合,等待噬菌體的作用效果即可,之后通過(guò)Sample6 Luminometer檢測(cè)發(fā)射光,并將結(jié)果輸入公司的軟件中,該軟件跟蹤溯源被污染的產(chǎn)品,從而可以提供一些分析信息,例如污染是否與特定的時(shí)間、人員或供應(yīng)商相關(guān)。該方法具有極高的特異性和靈敏性,無(wú)需經(jīng)過(guò)其他大多數(shù)方法所必須的擴(kuò)增或培養(yǎng)過(guò)程,是世界上第一個(gè)具有實(shí)用價(jià)值的“自我富集病原體診斷系統(tǒng)”。

美國(guó)Micro Phage公司研發(fā)出一種針對(duì)金黃色葡萄球菌的噬菌體擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù),用FAST Plaque-Response試劑盒能夠區(qū)分對(duì)甲氧西林有抗性的金黃色葡萄球菌和無(wú)抗性的菌株,該公司也針對(duì)其他重要的細(xì)菌(包括不同的抗生素抗性)研發(fā)了噬菌體擴(kuò)增檢測(cè)的方法,這些產(chǎn)品已在歐盟、北美上市[53]。隨著科技的發(fā)展,由試劑公司開(kāi)發(fā)的商業(yè)化熒光試劑如YOYO、SYTO、SYBR Green I等也在很大程度上代替了傳統(tǒng)的熒光染料[1]。此外,商業(yè)熒光素Nano-Glo也因其產(chǎn)生的生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)烈而具有應(yīng)用價(jià)值[54]。

雖然如今還是存在許多阻礙噬菌體檢測(cè)方法商業(yè)化的因素,但不可否認(rèn)的是,基于噬菌體的檢測(cè)方法因其具有的明顯優(yōu)勢(shì)而必然成為食源性病原菌快速檢測(cè)方法新的發(fā)展方向之一。尤其是隨著基因工程、基因組測(cè)序[55-56]和納米技術(shù)等在噬菌體應(yīng)用領(lǐng)域的逐漸深入,將進(jìn)一步加速其成為商業(yè)化快速檢測(cè)方法的進(jìn)程[20]。

國(guó)內(nèi)已有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室研究開(kāi)發(fā)出了有關(guān)噬菌體檢測(cè)和控制食源性病原菌的技術(shù)方法[57],展示出較好的應(yīng)用前景,如何突破應(yīng)用瓶頸、提高其實(shí)用性,走出實(shí)驗(yàn)室,走向市場(chǎng),成為研究人員面臨的一大挑戰(zhàn)。

5 結(jié) 語(yǔ)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,食品安全問(wèn)題受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注,食源性病原菌則是影響食品安全的主要因素之一。傳統(tǒng)的檢測(cè)手段已經(jīng)很難滿足現(xiàn)代食品工業(yè)對(duì)于食品安全快速檢測(cè)的要求,食源性病原菌的檢測(cè)技術(shù)面臨著向省時(shí)簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確高效的現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)轉(zhuǎn)型的問(wèn)題。噬菌體由于具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、價(jià)格低廉等特點(diǎn),加之其作為現(xiàn)有的極少數(shù)能夠鑒別區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌的檢測(cè)方法之一,漸漸成為研究的熱點(diǎn)。基于噬菌體延伸出來(lái)的檢測(cè)方法多種多樣,每種方法都有一定的長(zhǎng)處與不足,但往往可以在現(xiàn)有技術(shù)中提供一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì),如敏感度高、檢測(cè)限低或檢測(cè)成本低等。同時(shí),研究人員也傾向于把噬菌體與免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、傳感器技術(shù)等檢測(cè)方法聯(lián)合使用,將其作為必要的補(bǔ)充技術(shù)以獲得更好的檢測(cè)效果。此外,隨著人們對(duì)噬菌體認(rèn)識(shí)和研究的逐步深入,噬菌體編碼的內(nèi)溶素酶、CBD、TSP等因其所具有的高親和性和易操作性引起了關(guān)注,并已經(jīng)在一定程度上替代抗體等應(yīng)用于食源性病原菌的檢測(cè)。近年來(lái),國(guó)外已涌現(xiàn)出一批開(kāi)發(fā)噬菌體相關(guān)檢測(cè)產(chǎn)品的公司,如法國(guó)生物梅里埃公司、美國(guó)Sample6公司、美國(guó)Micro Phage公司等,并已取得顯著進(jìn)展,陸續(xù)有相關(guān)產(chǎn)品初步投入市場(chǎng)。伴隨著生物領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,以及對(duì)于現(xiàn)有應(yīng)用瓶頸的突破,噬菌體及其相關(guān)產(chǎn)物必然將在食品安全檢測(cè)中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用,逐步走向市場(chǎng)化和常規(guī)化。

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