陳 益，夏艷勛，賀桂芬，鄧同煒，李文剛，石冬梅

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，鄭州 450046）

兔球蟲病是家兔最常見的原蟲病，在我國各地廣泛流行，幼兔幾乎100%感染，死亡率極高［1-5］，由于無有效疫苗，該病主要依賴化學(xué)藥物防治。聚維酮碘、二氧化氯和三氯異氰尿酸是生產(chǎn)中常用消毒劑，對細(xì)菌、病毒等高效，但迄今未見其抑殺球蟲卵囊的研究報道。本試驗選用這3種消毒劑在不同條件下體外作用于兔球蟲卵囊，以檢測其對兔球蟲卵囊孢子化的影響，為兔球蟲病的防制提供參考。

1 材料

1.1 聚維酮碘 濃度99.8%，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司生產(chǎn)。配制成500 mg/L、1 000 mg/L、2 000 mg/L三種不同濃度溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 二氧化氯 有效氯12%，北京京久環(huán)?？萍加邢薰旧a(chǎn)。配成不同有效氯濃度溶液：25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 三氯異氰尿酸 有效氯450 mg/g，德清縣康博消毒化工有限公司生產(chǎn)。配成3種不同有效氯溶液：250 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 重鉻酸鉀 分析純，上海浦江化工廠生產(chǎn)。稱取2.5 g重鉻酸鉀溶于100 mL蒸餾水，配成2.5%重鉻酸鉀溶液備用。

2 方法

2.1 卵囊收集

采集加利福利亞兔2 h內(nèi)排出的糞便，研細(xì)，加入約10倍體積的飽和鹽水，充分?jǐn)噭颍^濾，收集濾液并以3 000 r/min離心15 min，用膠頭滴管吸取表層溶液，然后將溶液混于10倍體積蒸餾水中，9 000 r/min離心5 min，棄上清，收集沉淀，加適量2.5%重鉻酸鉀溶液，置 4 ℃冰箱備用［6］。

2.2 卵囊孢子化抑制試驗

將保存于2.5%重鉻酸鉀的卵囊溶液9 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加適量蒸餾水洗滌后9 000 r/min離心5 min，收集沉淀，重復(fù)洗滌3次，在最終沉淀中加入蒸餾水，使卵囊數(shù)每毫升約4 000個。分別吸取200 μL卵囊液加入到1 800 μL上述3種不同濃度消毒劑溶液中，充分混勻，對照組以蒸餾水代替消毒液，室溫靜置。第5、15、30和60分鐘各吸取500 μL處理后卵囊液于2 mL EP 管中，離心（9 000 r/m，離心 5 min），棄上清，沉淀加2 mL蒸餾水以同樣轉(zhuǎn)速離心洗滌3次，最后在沉淀中加入500 μL 2.5%重鉻酸鉀溶液，置29℃恒溫箱中通氣培養(yǎng)，間斷性震蕩。

2.3 卵囊孢子化率計算

卵囊培養(yǎng)后第24、48和72小時分別統(tǒng)計各組孢子化卵囊數(shù)及總數(shù)，每次計數(shù)3次，求其平均值，計算卵囊孢子化率，卵囊孢子化率（%）=孢子化卵囊（/孢子化卵囊+未孢子化卵囊）×100%。

2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 聚維酮碘對兔球蟲卵囊孢子化的影響

由表1可見，培養(yǎng)24 h后，對照組卵囊孢子化率為68.23%，聚維酮碘不同處理組孢子化率集中在67.68%～68.40%間，與對照組無顯著差異（P＞0.05）。培養(yǎng)48 h和72 h后，聚維酮碘各處理組卵囊孢子化率略低于對照組，但差異均不顯著（P＞0.05）。此外，孢子化培養(yǎng)24、48和72 h后，聚維酮碘各濃度組在不同處理時間上均無明顯差異。

表1 不同條件下聚維酮碘對兔球蟲卵囊孢子化率的影響

3.2 二氧化氯對兔球蟲卵囊孢子化率的影響

如表2所示，培養(yǎng)24、48和72 h后，除個別組外，3種濃度的二氧化氯對卵囊不同作用時間后卵囊孢子化率總體上均略低于對照組，但均未達到顯著水平（P＞0.05），同時各組不同作用時間差異也不明顯（P＞0.05）。不難看出，二氧化氯各試驗組卵囊孢子化率與對照組差異不明顯（P＞0.05），揭示有效氯為25～100 mg/L的二氧化氯溶液對兔球蟲卵囊孢子化基本無抑制作用。

表2 二氧化氯不同條件下的兔球蟲卵囊孢子化率

3.3 三氯異氰尿酸對兔球蟲卵囊孢子化率的影響

由表3可知，培養(yǎng)24 h后，各組孢子化率50.88%～59.71%，均顯著低于對照組68.23%（P＜0.05）。培養(yǎng)48 h和72 h后，各處理組孢子化率均低于相應(yīng)對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。此外，同一濃度三氯異氰尿酸對卵囊不同處理時間比較顯示，僅1 000 mg/L組在培養(yǎng)24 h后不同處理時間表現(xiàn)出一定差異，尤其以處理60 min組顯著低于處理15 min組（P＜0.05）。綜合分析發(fā)現(xiàn)，三氯異氰尿酸對兔球蟲卵囊孢子化有一定抑制作用，且隨三氯異氰尿酸濃度的升高而增強；而在同一濃度三氯異氰尿酸對卵囊不同作用時間下，總體上各處理組間的卵囊孢子化差異不明顯。

表3 三氯異氰尿酸不同條件下的兔球蟲卵囊孢子化率

4 討論

在一定溫度下，球蟲卵囊迅速孢子化發(fā)育到感染性階段，因此阻止其孢子化是防止動物感染球蟲的關(guān)鍵措施之一。目前，已發(fā)現(xiàn)一些化學(xué)藥物可體外抑制球蟲卵囊孢子化，如有試驗發(fā)現(xiàn)，10%氨水可抑制球蟲卵囊孢子化［7-8］，但高濃度氨水對動物呼吸道黏膜刺激性強，容易誘發(fā)呼吸道疾?。?-10］，因此難以推廣。此外，碘制劑對球蟲卵囊孢子化也有一定作用。張龍現(xiàn)等［8］報道，3%碘酊和2%碘酊醋酸液體外作用球蟲卵囊30 min，可完全抑制球蟲卵囊孢子化。陳漢忠等［11］也報道，含碘0.05%的復(fù)合消毒液可較好地抑制雞球蟲卵囊孢子化。本試驗結(jié)果表明，聚維酮碘溶液對兔球蟲卵囊孢子化基本無抑制作用，可能與聚維酮碘濃度較低有關(guān)，有待于進一步探索。

二氧化氯和三氯異氰尿酸具有強烈的氧化作用，對細(xì)菌、病毒、真菌等效果良好。本試驗中二氧化氯溶液（按有效氯計，25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L）在不同作用時間下，均未明顯地表現(xiàn)出對兔球蟲卵囊孢子化的抑制作用，這可能與二氧化氯濃度較低有關(guān)。三氯異氰尿酸溶液各處理組的卵囊孢子化率均低于對照組，尤其是培養(yǎng)24 h抑制作用最強。此外，三氯異氰尿酸溶液隨濃度升高，對兔球蟲卵囊孢子化抑制效果越好。綜合分析，二氧化氯及三氯異氰尿酸溶液的抑制結(jié)果，有效氯低于100 mg/L幾乎無抑制作用，250 mg/L以上有一定抑制作用，表明高濃度的含氯消毒劑對兔球蟲卵囊孢子化有抑制作用。